专利名称：嘧啶类化合物的制作方法：本发明涉及嘧啶类衍生物或其药学可接受盐或体内可水解酯，它们具有细胞周期抑制活性并因此有益于其抗癌(例如抗细胞增殖、抗细胞转移和/或细胞凋亡)活性，所以适用于温血动物如人体的治疗方法中。本发明还涉及所述嘧啶类衍生物的制备方法、含有它们的药物组合物及其在制备药物中地用途或在温血动物如人体中产生抗癌(抗细胞增殖/转移和/或细胞凋亡)作用的应用。一个家族的称作细胞周期蛋白的细胞内蛋白在细胞周期中发挥着核心作用。细胞周期蛋白的合成和降解受到严格控制，使其表达水平在细胞周期的过程中上下波动。细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶(CDKs)结合，而这种关联是细胞内CDK(例如CDK1，CDK2，CDK4和/或CDK6)作用所必须的。虽然人们对这些因子如何联合调节CDK活性的准确详情知之甚少，但两者之间的平衡指导细胞无论如何将通过细胞周期进化。癌基因和肿瘤抑制基因研究的最新焦点是已经鉴定出进入细胞周期的调控作用是肿瘤中致有丝分裂的关键控制点。此外，CDKs似乎是许多癌基因信号传导途径的下游。通过细胞周期蛋白的上调和/或内源性抑制剂的缺失导致的CDK失调似乎是致有丝分裂信号传导途径和肿瘤细胞增殖作用之间的重要枢轴。所以人们已经认识到，细胞周期激酶的抑制剂，特别是CDK2、CDK4和/或CDK6(它们分别在S-期、G1-S和G1-S期运作)的抑制剂应该是有价值的细胞增殖的选择性抑制剂，例如哺乳动物癌细胞的生长。此外，相信粘着斑激酶(FAK)的抑制可以导致细胞凋亡(细胞死亡)和/或抑制细胞转移，这种激酶参与信号传导途径，因此FAK的抑制剂可以是有价值的抗癌药物。本发明是基于发现了某些2，4-嘧啶类化合物令人惊奇地抑制细胞周期激酶的作用，显示出对CDK2、CDK4和CDK6的选择性，并且还抑制FAK，所以具有抗癌(抗细胞转移/增殖和/或细胞凋亡)特性。这些特性在与异常细胞周期和细胞增殖有关的疾病状态的治疗中被认为是有价值的，所述疾病状态例如是癌症(实体瘤和白血病)、纤维增殖性和分化性失调、细胞凋亡、牛皮癣、风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、粉瘤、动脉粥样硬化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性和慢性炎症、骨疾病和具有视网膜血管增生的眼疾病。按照本发明提供式(I)的嘧啶类衍生物 其中Q1和Q2独立地选自芳基或碳连接的杂芳基；和Q1和Q2之一或Q1和Q2两者在环碳上被一个式(Ia)的取代基取代 ；其中
X是-CH2-、-O-、-NH-、-NRa-或-S-[其中Ra是C1-4烷基，其任选地被一个选自下列的取代基取代卤素、氨基、氰基、C1-4烷氧基或羟基]；
Y1是H、C1-4烷基或如对Z定义；
Y2是H或C1-4烷基；
Z是RbO-、RcRdN-、ReS-、RfRgNNRh-、氮连接的杂芳基或氮连接的杂环[其中所述杂环任选地在环碳上或环氮上被C1-4烷基或C1-4烷酰基取代]其中Rb，Rc，Rd，Re，Rf，Rg和Rh独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4链烯基、C3-8环烷基，和其中该C1-4烷基和C2-4链烯基任选地被一个或多个苯基取代；
n是1、2或3；
m是1、2或3；
G是-O-或-S-；
R1选自氢、卤素、羟基、硝基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、氰基、三氟甲基、三氯甲基、C1-3烷基[任选地被1或2个独立选自下列的取代基取代卤素、氰基、氨基、N-(C1-3烷基)氨基、N，N-二-(C1-3烷基)氨基、羟基和三氟甲基]、C3-5链烯基[任选地被至多3个卤素取代基取代，或被一个三氟甲基取代基取代]、C3-5炔基、C1-3烷氧基、巯基、C1-3烷基硫基(sulphanyl)、羧基和C1-3烷氧基羰基；
Q1任选地在环碳上被1-4个独立选自下列的取代基取代卤素、巯基、硝基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、氰基、氨基、脲基、氨基甲酰基、氨磺酰基、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基[其中该C1-4烷基、C2-4链烯基和C2-4炔基任选地被一个或多个选自R1的基团取代]、C1-4烷酰基、C1-4烷氧基羰基、杂环基、C1-4烷基S(O)a其中a是0-2[任选地被羟基取代]、N’-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-C1-4烷基)氨磺酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基和C1-4烷酰基氨基；
并且还独立地，或者除上述取代基以外，Q1可以任选地被1-2个独立选自下列的取代基取代芳基、C3-8环烷基和杂环基；其中该芳基、C3-8环烷基或杂环基可以任选地在环碳上被一个或多个选自Rj的基团取代；并且其中如果该杂环基含有-NH-部分，其氮可以任选地被选自Rk的基团取代；
Q2任选地在环碳上被1-4个独立选自下列的取代基取代卤素、羟基、巯基、硝基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、氰基，氨基、脲基、氨基甲酰基、氨磺酰基、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基[其中该C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基和C1-4烷氧基任选地被一个或多个选自Rl的基团取代]、C1-4烷酰基、C1-4烷氧基羰基、杂环基、C1-4烷基S(O)a其中a是0-2[任选地被羟基取代]、N’-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)脲基、N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N’，N’-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C2-4链烯基氧基、C2-4炔基氧基、C1-4烷酰基氨基和定义如上的式(Ia)或(Ia′)的基团；
并且还独立地，或者除上述取代基以外，Q2可以任选地被1-2个独立选自下列的取代基取代芳基、C3-8环烷基或杂环基；其中该芳基、C3-8环烷基或杂环基可以任选地在环碳上被一个或多个选自Rm的基团取代；和其中如果该杂环基含有-NH-部分，其氮可以任选地被选自Rm的基团取代；
Ri和Rl独立地选自羟基、卤素、氨基、氰基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、硝基、巯基、氨基甲酰基、氨磺酰基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4烷酰基、C1-4烷酰基氧基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4烷酰基氨基、C1-4烷基S(O)a其中a是0-2，C1-4烷基磺酰基氨基、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-(C1-4烷基)2氨磺酰基、N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、N-(C1-4烷基)2氨基甲酰基、苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8环烷基和杂环基；其中该苯基、苯硫基、苯氧基、C3-8环烷基或杂环基可以任选地在环碳上被一个或多个选自Ro的基团取代；和其中如果该杂环基含有-NH-部分，其氮可以任选地被选自Rp的基团取代；
Ri，Rm和Ro独立地选自羟基、卤素、氨基、氰基、甲酰基、甲酰氨基、羧基、硝基、巯基、氨基甲酰基、氨磺酰基、C1-4烷基[任选地被一个或多个选自下列的基团取代卤素、氰基，氨基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基或羟基]、C2-4链烯基[任选地被一个或多个选自卤素的基团取代]、2-4炔基、N-C1-4烷基氨基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基、C1-4烷酰基、C1-4烷酰基氧基、C1-4烷氧基[任选地被一个或多个选自卤素的基团取代]、C1-4烷氧基羰基、N-C1-4烷基氨基甲酰基、N，N-二-(C1-4烷基)氨基甲酰基、C1-4烷酰基氨基、C1-4烷基S(O)a其中a是0-2，C1-4烷基磺酰基氨基、N-(C1-4烷基)氨磺酰基、N-(C1-4烷基)2氨磺酰基、苯基、C3-8环烷基和杂环基；和
Rk，Rn和Rp独立地选自C1-4烷基、C1-4烷酰基、C1-4烷基磺酰基、C1-4烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、N，N-(C1-4烷基)氨基甲酰基、苄基、苄氧基羰基、苯甲酰基和苯基磺酰基；
或其药学可接受盐或体内可水解酯。
″芳基″是全部或部分不饱和的、单或双环碳环，其含有4-12个原子。优选″芳基″是含有5或6个原子的单环环或含有9或10个原子的双环环。更优选″芳基″是苯基、萘基、四氢萘基或二氢茚基。特别是″芳基″是苯基、萘基或二氢茚基。更加特别″芳基″是苯基。
″碳连接的杂芳基″是完全不饱和的5-或6-员单环环或者9-或10-员双环环，其至少一个原子选自氮、硫或氧。这种环经碳原子与-NH-(对于Q1)或G(对于Q2)相连。优选″碳连接的杂芳基″是呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁坐基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、呋咱基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、喹啉基或苯并咪唑基。更优选″碳连接的杂芳基″是吡啶基、噻唑基或吡唑基。特别″碳连接的杂芳基″是吡啶基。
″杂环基″是饱和、部分饱和或不饱和的含有4-12个原子的单环或双环环，其至少一个原子选自氮、硫或氧，除非另外说明，其可以是碳或氮连接的，其中-CH2-基团可以任选地被-C(O)-置换，并且环硫原子可以任选地氧化形成S-氧化物(一个或多个)。优选″杂环基″是吡咯烷基、吗啉代、哌啶基、吡啶基、吡喃基、吡咯基、异噻唑基、吲哚基、喹啉基、噻吩基、呋喃基、1，3-苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、噻二唑基、哌嗪基、噻唑烷基、吡咯烷基、硫代吗啉代、吡唑基、吡咯啉基、高哌嗪基、四氢吡喃基、咪唑基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、异噁唑基、4-吡啶酮、1-异喹诺酮、2-吡咯烷酮、4-噻唑烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮杂-8-氧杂[3，2，1]己烷。更优选″杂环基″是吡咯烷基、吗啉代、哌啶基、吲哚基、噻吩基、呋喃基、哌嗪基、硫代吗啉代、吡唑基、咪唑基、2-吡咯烷酮、咪唑并[1，2-a]吡啶或3-氮杂-8-氧杂双环[3，2，1]己烷。
适当值″氮连接的杂芳基″是具有一定不饱和度、含有4-12个原子的单环或双环，所述原子中至少一个选自氮，并且任选地1-3个其它原子选自氮、硫或氧，其中-CH2-基团可以任选地被-C(O)-置换，和环硫和/或氮原子可以任选地氧化形成S-氧化物(一个或多个)和/或N-氧化物。适当的″氮连接的杂芳基″是含有5或6个原子的单环或者含有9或10个原子的双环。氮键产生形成了中性化合物。适合″氮连接的杂芳基″的值包括咪唑-1-基、吡咯啉-1-基、咪唑啉-1-基、吡唑啉-1-基、三唑-1-基、吲哚-1-基、异吲哚-2-基、吲哚啉-1-基、苯并咪唑-1-基、吡咯-1-基或吡唑-1-基。优选″氮连接的杂芳基″是咪唑-1-基。
适当值″氮连接的杂环″是含有4-12个原子的不饱和单环或双环，中性原子中至少一个选自氮，并且任选地1-3个其它原子选自氮、硫或氧，其中-CH2-基团可以任选地被-C(O)-置换，和环硫可以任选地氧化生成S-氧化物(一个或多个)。适当的″氮连接的杂环″是含有5或6个原子的单环或者含有9或10硅原子的双环。适合″氮连接的杂环″的值包括吡咯烷-1-基、哌啶子基、哌嗪-1-基、吗啉代、硫代吗啉代、高哌啶基或高哌嗪-1-基。优选″氮连接的杂环″是吡咯烷-1-基、哌嗪-1-基或吗啉代。更优选″氮连接的杂环″是吡咯烷-1-基或哌嗪-1-基。
在本说明书中术语″烷基″包括直链或支链烷基，但对于各个烷基如″丙基″仅仅是指直链形式。类似的约定适用于其它一般性术语。
″卤素″是氟、氯、溴和碘。
C2-4链烯基的实例是乙烯基和烯丙基；C2-6链烯基的实例是C3-5链烯基、乙烯基和烯丙基；C3-6链烯基的实例是烯丙基；C1-6炔基的实例是C3-5炔基和丙炔-2-基；C2-4炔基的实例是乙炔基和丙炔-2-基；C2-6炔基的实例是乙炔基和丙炔-2-基；C1-4烷酰基的实例是乙酰基和丙酰基；C1-4烷氧基羰基的实例是C1-3烷氧基羰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基和叔丁氧基羰基；C1-4亚烷基的实例是亚甲基、亚乙基和亚丙基；C1-4烷基的实例是C1-3烷基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；C1-6烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和3-甲基丁基；C1-4烷氧基的实例C1-3烷氧基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基；C2-4链烯基氧基的实例烯丙基氧基；C2-4炔基氧基的实例是丙炔基氧基；C1-4烷基S(O)a其中a是0-2的实例是C1-3烷基硫烷基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丙基亚磺酰基、甲磺酰基、乙基磺酰基和丙基磺酰基；N-C1-4烷基氨基甲酰基的实例是N-甲基氨基甲酰基、N-乙基氨基甲酰基和N-丙基氨基甲酰基；N，N-二-(C1-4烷基)-氨基甲酰基的实例是N，N-二甲基氨基甲酰基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰基和N，N-二乙基氨基甲酰基；N-C1-4烷基氨基的实例是N(C1-3烷基)氨基、甲基氨基、乙基氨基和丙基氨基；N，N-二-(C1-4烷基)氨基的实例是N，N-二-(C1-3烷基)氨基、二甲基氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二乙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基和二丙基氨基；C1-4烷酰基氨基的实例是乙酰氨基、丙酰氨基和丁酰氨基；C3-8环烷基的实例是环丙基、环戊基和环己基；C1-4烷酰基的实例是乙酰基和丙酰基；C1-4烷酰氧基的实例是乙酰氧基和丙酰氧基；N′-(C1-4烷基)脲基的实例是N-甲基脲基和N-乙基脲基；N′，N′-二-(C1-4烷基)脲基的实例是N′，N′-二甲基脲基、N′，N′-二异丙基脲基和N′-甲基-N′-丙基脲基；N′-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基的实例是N-甲基-N-乙基脲基和N′-甲基-N-甲基脲基；N′，N′-二-(C1-4烷基)-N-(C1-4烷基)脲基的实例是N’，N’-二甲基-N-乙基脲基和N′-甲基-N′-丙基-N-丁基脲基；N-(C1-4烷基)氨磺酰基的实例是N-甲基氨磺酰基和N-异丙基氨磺酰基；N，N-二-(C1-4烷基)氨磺酰基的实例是N-甲基-N-乙基氨磺酰基和N，N-二丙基氨磺酰基；和C1-4烷基磺酰基氨基的实例是甲磺酰基氨基、乙基磺酰基氨基和丙基磺酰基氨基。
本发明的嘧啶类衍生物的适当药学可接受盐是例如本发明的具有足够碱性的嘧啶类衍生物的酸加成盐，例如与如无机或有机酸的酸加成盐，所述酸譬如是盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、柠檬酸或苹果酸。此外本发明的具有足够酸性嘧啶类衍生物的适当药学可接受盐是碱金属盐，例如钠或钾盐，和碱土金属盐，如钙或镁盐，铵盐或与提供生理可接受阳离子的无机碱的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺的盐。
式(I)的化合物可以以前药的形式给药，其在人体或动物机体内分解产生式(I)的化合物。前药的实例包括式(I)化合物的体内可水解酯。
含有羧基或羟基的式(I)的化合物的体内可水解酯是，例如在人体或动物机体内水解产生母体酸或醇的药学可接受酯，适当的羧酸的药学可接受酯包括C1-6烷氧基甲酯，例如甲氧基甲基；C1-6烷酰氧基甲酯，例如新戊酰氧基甲基，2-苯并[c]呋喃酮基酯，C3-8环烷氧基羰羰基，C1-6烷基酯，例如1-环己基羰氧基乙基；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲酯，例如5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基；和C1-6烷氧基羰氧基乙酯，例如1-甲氧基羰氧基乙基并且可以在本发明化合物中的任何羧基处形成。
含有羟基的式(I)的化合物的体内可水解酯包括无机酯，例如磷酸酯，和α-酰氧基烷基醚和有关化合物，其是所述酯的体内水解的产物分解释放出母体羟基。α-酰氧基烷基醚包括乙酰氧基甲氧基和2，2-二甲基丙酰氧基-甲氧基。对与羟基形成体内可水解酯基团的选择包括烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和被取代的苯甲酰基和苯基乙酰基、烷氧基羰基(得到烷基碳酸酯)、二烷基氨基甲酰基和N-(二烷基氨基乙基)-N-烷基氨基甲酰基(得到氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。苯甲酰基上的取代基的实例包括从环氮原子经亚甲基与苯甲酰基环的3-或4-位相连的吗啉代和哌嗪子基。
一些式(I)的化合物可以具有手性中心和/或geomet几何异构中心(E-和Z-异构体)，和应理解本发明包括所有具有CDK和/或FAK抑制活性的这些光学、非对映立体异构体和几何异构体。
本发明涉及任何和全部具有CDK和/或FAK抑制活性的式(I)的化合物的互变异构形式。
应理解某些式(I)的化合物可以操作溶剂化和非溶剂化形式，例如水合物形式。可以理解本发明包括全部这些具有CDK和/或FAK抑制活性的的溶剂化物。
特别优选本发明的化合物包括式(I)的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯，其中R1，Q1，Q2和G具有上述定义或者任何下面的值。这些值可以在适当时与任何上下文中的定义、权利要求或实施方式使用。
优选Q1和Q2独立地选自苯基、吡啶基、噻唑基和吡唑基。
更优选Q1和Q2独立地选自苯基和噻唑基。
在本发明的另一方面中，更优选Q1和Q2独立地选自苯基和噻唑基。
优选Q1是苯基。
优选Q2是苯基、吡啶基、噻唑基或吡唑基。
更优选Q2是苯基或噻唑基。
在本发明的另一方面中，更优选Q1是苯基或吡啶基。
优选Q1是苯基和Q2选自苯基、吡啶基、噻唑基和吡唑基。
更优选Q1是苯基和Q2选自苯基和噻唑基。
在本发明的另一方面中，更优选Q1是苯基和Q2选自苯基和吡啶基。
优选在取代基(Ia)中，X是-O-，Y1是OH，Y2是H，Z是RcRdN-或氮连接的杂环[其中该杂环任选地在环氮上被C1-4烷酰基取代]和其中Rc和Rd独立地选自氢、C1-4烷基和C3-8环烷基，n是1和m是1。
更优选在取代基(Ia)中，X是-O-，Y1是OH，Y2是H，Z是氨基、甲基氨基、乙基氨基、异丙基氨基、异丁基氨基、叔丁基氨基、二甲基氨基、环戊基氨基、吡咯烷-1-基或4-乙酰基哌嗪-1-基，n是1和m是1。
特别是取代基(Ia)是3-氨基-2-羟基丙氧基、3-甲基氨基-2-羟基丙氧基、3-二甲基氨基-2-羟基丙氧基、3-乙基氨基-2-羟基丙氧基、3-异丙基氨基-2-羟基丙氧基、3-异丁基氨基-2-羟基丙氧基、3-t-丁基氨基-2-羟基丙氧基、3-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-羟基丙氧基、3-环戊基氨基-2-羟基丙氧基或3-吡咯烷-1-基-2-羟基丙氧基。
更加特别该取代基(Ia)是3-二甲基氨基-2-羟基丙氧基、3-异丙基氨基-2-羟基丙氧基、3-叔丁基氨基-2-羟基丙氧基或3-环戊基氨基-2-羟基丙氧基。
优选式(Ia)的取代基位移环Q1中。
优选当Q1是苯基时，式(Ia)的取代基位于-NH-的对位或间位。
更优选当Q1是苯基时，式(Ia)的取代基相对于-NH-来说位于对位。
在本发明的一个方面中优选G是-O-。
在本发明的另一方面中优选G是-S-。
优选Rl是氟、氯或溴。
更优选Rl是溴。
优选Q1除被式(Ia)的取代基之外未被取代。
优选Q2未取代或被一个甲氧基取代。
优选Q2是苯基、4-甲氧基苯基或噻唑-2-基。
所以，本发明的有关优选方面，提供了定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，其中
Q1和Q2独立地选自苯基和噻唑基；Q2未取代或被一个甲氧基取代；和Q1在环碳上被定义如上的式(Ia)的取代基取代，其中X是-O-，Y1是OH，Y2是H，Z是RcRdN-或氮连接的杂环[其中该杂环在环氮上被C1-4烷酰基取代]和其中Rc和Rd独立地选自氢、C1-4烷基和C3-8环烷基，n是1和m是1；
G是-O-或-S-；和
Rl是氟、氯或溴；或其药学可接受盐或体内可水解酯。
所以，在本发明的一个更优选方面，提供定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，其中
更优选Q1是苯基和Q2选自苯基和噻唑基；Q2是未取代或被一个甲氧基取代；和Q1在环碳上被下列基团取代3-氨基-2-羟基丙氧基、3-甲基氨基-2-羟基丙氧基、3-二甲基氨基-2-羟基丙氧基、3-乙基氨基-2-羟基丙氧基、3-异丙基氨基-2-羟基丙氧基、3-异丁基氨基-2-羟基丙氧基、3-t-丁基氨基-2-羟基丙氧基、3-(4-乙酰基哌嗪-1-基)-2-羟基丙氧基、3-环戊基氨基-2-羟基丙氧基或3-吡咯烷-1-基-2-羟基丙氧基；
G是-O-或-S-；和
Rl是溴；或其药学可接受盐或体内可水解酯。
在本发明的一个方面，本发明的优选化合物是实施例1、6、14、15、16或17的化合物或其药学可接受盐或体内可水解酯。
在本发明的另一方面，本发明的优选化合物包括实施例的任何一种化合物或其药学可接受盐或体内可水解酯。
本发明的优选方面是涉及所述化合物或其药学可接受盐的那些。
式(I)的嘧啶类衍生物或其药学可接受盐或体内可水解酯可以通过适用于制备化学上相关化合物的已知方法来制备。当用来制备式(I)的嘧啶类衍生物或其药学可接受盐或体内可水解酯时，这些方法是本发明的另外的特征并且通过下列代表实施例举例说明，其中除非另外说明，Rl，1，Q2和G具有定义式(I)的嘧啶类衍生物的任何含义，而且除非在环Q1或Q2环上画出另外的取代基，否则该环可以带有任何上面定义的取代基(除非另外说明)。当将取代基画在环Q1上时，这包括(除非另外说明)出位于环Q1上的取代基以外或代替环Q1上取代基的环Q2上的取代基。通过有机化学的标准方法可以得到必要的起始原料(参见例如，Advanced Organic Chemistry(Wiley-Interscience)，Jerry March-also useful for general guidance on reactionconditions and reagents)。此类起始原料的制备描述在所附的非限定方法和实施例中。
同样地，通过与举例说明方法相类似的方法可以获得必要的起始原料，这些方法属于有机化学的普通技术人员的范围内。
所以，本发明的另一特征提供下列方法，其包括-a)对于式(I)的化合物；式(II)的嘧啶
其中L是定义如下的可替换基团，与式(III)的化合物反应
b)式(IV)的嘧啶
其中L是定义如下的可替换基团，与式(V)的化合物反应
c)对于式(1)的化合物，其中n是1、2或3，m＝1，Y2是H和Y2是OH、NH或SH；通过式(VI)的3-员杂烷基环
其中A是O、S或NH；与式(VII)的亲核试剂反应
Z-D (VII)其中D是H或适当的抗衡离子；
d)对于式(I)的化合物，其中X是氧；通过式(VIII)
与式(IX)的醇反应
e)对于式(I)的化合物，其中X是-CH2-、-O-、-NH-或-S-，Y1是OH，Y2是H和m是2或3；式(X)的化合物
其中LgO是定义如下的离去基团；与式(VII)的亲核试剂反应；f)对于式(I)的化合物，其中X是-CH2-、-O-、-NH-或-S-；Y1和Y2是H；n是1、2或3和m是1、2或3；式(XI)的化合物
其中LgO是定义如下的离去基团；与式(VII)的亲核试剂反应；g)对于式(I)的化合物，其中X是-O-、-NH-或-S-；Y1和Y2是H；n是1、2或3和m是1、2或3；式(XII)的化合物
与式(XIII)的化合物反应
其中L单环定义如下的可替换基团；h)对于式(I)的化合物，其中Z是HS-，通过将硫代乙酸酯基转化为相应的化合物；和此后如果必要i)将一种式(I)的化合物转化为另一种式(I)的化合物；ii)除去任何保护基；iii)生成药学可接受盐或体内可水解酯。
L是可替换基团，适合L的值是例如，卤素、磺酰氧基或硫基，如氯、溴、甲磺酰氧基、甲苯-4-磺酰氧基、甲磺酰基、甲硫基和甲基亚磺酰基。
上述反应的具体反应条件如下所述方法a)
式(II)的化合物和式(III)的化合物可以一起反应，任选地在适当碱的存在下进行，所述碱例如是无机碱，如碳酸钾。该反应优选在适当的惰性溶剂或稀释剂中，例如二氯甲烷(DCM)、乙腈、丁醇、环丁砜、四氢呋喃、1，2-二甲氧基乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷-2-酮，并在例如0-150℃的温度内进行，通常是在或接近室温下进行。
式(II)的嘧啶可以按照下面路线合成
其中Ra是被任选取代的烷基或芳基和L是定义如上的可替换基团。优选Ra是甲基、乙基或对甲苯基。
式(III)的化合物可以商购或通过所属领域的已知方法制备。方法b)
式(IV)的嘧啶和式(V)的苯胺类化合物可以一起反应，i)在适当溶剂的存在下，例如酮(如丙酮)或醇(如乙醇或丁醇)或芳烃(如甲苯或N-甲基吡咯烷)，任选地在适当酸的存在下，例如定义如上的酸(或适当的路易斯酸)并且在0℃-回流的稳定性进行，优选回流；或ii)在上述标准Buchwald条件下进行。
式(IV)的嘧啶是按照是按照下面路线制备
其中L是定义如上的可替换基团。
式(V)的苯胺类化合物商购或通过所属领域的已知方法制备。
式(IVA)的嘧啶商购或通过，例如，其中L是-OH的式(IVA)的化合物(即尿嘧啶)与POCl3反应得到其中L是-Cl的式(IVA)化合物。方法c)
式(VI)的三员杂烷基环和式(VII)的亲核试剂在20-100℃，优选20-50℃的温度内反应，该反应任选地在适当溶剂的存在下进行，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃。
式(VI)的化合物可以按照下列路线制备路线I)
对于式(VI)的化合物，其中A是O，和X不是碳
(VIB)向(VI)的转化也可以通过与Br-(CH2)n-CHO或当量酯在DMF中和碱的存在下反应来达到，随后与硫内鎓盐如(Me2SOCH2)在惰性溶剂如THF中反应(参见路线V)。路线II)
对于式(VI)的化合物，其中A是NH，和X不是碳
(PhINTs可参见例如，Tet.Let.，1997，38(39)，6897-6900；式(VIC)的化合物还可以在与下面路线IV类似的条件下氧化成为环氧化物)；路线III)
对于式(VI)的化合物，其中A是S，和X不是碳
(例如参见Synlett，1994，267-268)；路线IV)
对于式(VI)的化合物，其中X是碳
其中R3与其所连接的-COO-基团一起构成酯部分，例如甲酯或乙酯。路线V)
对于式(VI)的化合物，其中X是CH2、O、NH或S；Y1是OH；Y2是H；n是1、2或3和m是1
(VIJ)与(IV)(参见路线I)反应生成(VI)。
可以属于当量的(VIH)的酯。还参见Russ。Chem.Rev.47，975-990，1978。
式(VIH)、(VII)、(VIA)和(VID-1)的化合物可以商购或通过所属领域的已知方法制备。方法d)
式(VIII)的醇(例如酚类)和式(IX)的醇可以在标准Mitsunobu条件下反应，例如在二乙基跌倒羧酸酯和三苯基膦的存在下，在适当溶剂如二氯甲烷、甲苯或四氢呋喃中，并且在0-80℃的温度内，优选20-60℃。同样地，式(VIII)的醇(酚类)可以用适当的式(IX)的化合物烷基化，其中末端羟基被适当离去基团置换的。
式(VIII)的醇可以按照上面合成中间体(VIB)的方法I)制备(其中X是氧)。
式(IX)的醇可以商购或通过所属领域的已知方法制备。
在与d)类似的方法中，其中X是-S-的化合物可以通过其中羟基是-SH的式(VIII)的化合物与其中羟基是离去基团(如甲磺酸酯或甲苯磺酸酯)的式(IX)的化合物的反应来制备。方法e)
式(X)的化合物，其中X是-CH2-、-O-、-NH-或-S-；Y1是OH，Y2是H和m是2或3，与式(VII)的亲核试剂一起在20-100℃，优选20-50℃的温度内反应，任选地在适当溶剂的存在下进行，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃，和任选地在适当碱的存在下进行，例如碳酸钾。
式(X)的化合物是按照下面路线制备(m是2或3)
最后步骤中的步骤1)和2)的次序可以颠倒。适合步骤2)的碱是三乙胺。
式(XA)和(VII)的化合物可以商购或通过所属领域的已知方法制备。譬如，其中X是-NH-、-O-或-S-的式(XA)的化合物可以通过式(VIA)的化合物与适当卤代醛或当量酯在此类反应的标准条件下反应来制备。方法f)
式(XI)的化合物和式(VII)的亲核试剂按照上述方法e)所述一起反应。
式(XI)的化合物是以与制备上述式(X)化合物方法的最终步骤中的步骤2)相似的方式制备。必要的伯醇起始原料可以商购或者通过所属领域的已知方法制备。方法g)
式(XII)和(XIII)的化合物在惰性溶剂如DMF中在碱如碳酸钾的存在下反应。
式(XII)的化合物是在此所述的式(VIB)的化合物的相同通式，并且按照那些化合物所述的方法制备(参见路线I)。式(XIII)的化合物可以商购或通过所属领域的已知方法制备.方法h)
对于其中Z是SO的式(I)的化合物，相应化合物中硫代乙酸酯基的转化是按照式(IJ)向(IK)的化合物的转化方法进行。
适用的含硫代乙酸酯基的起始原料是从含离去基团如甲磺酸酯或甲苯磺酸酯基的相应化合物(利用标准条件从相应的羟基化合物制备)、利用巯基乙酸、按照此处所述的式(IG)向(IJ)的转化方法来制备。
一种式(I)的化合物向另一种式(I)的化合物的转化实例是i)使式(Ia)的一个侧链转化为式(Ia)的另一侧链；例如
I)对于式(I)的化合物，其中Y2是H和Y1不是羟基(该反应使用氨)
或II)对于式(I)的化合物，其中Y2是H和Y1是S
III)对于式(I)的化合物，其中Y2是H和Y1是H
应懂得，这些反应也适合将式(Ia)的一个侧链转化为式(Ia)的另一侧链。ii)利用标准技术将R1的一个值转化为R1的另一值，例如R1从羟基转化C1-4烷氧基。
专业读者应懂得，方法c)，d)，e)，f)，g)和h)和i)中所述的侧链(Ia)的处理也可以在中间体上完成， 例如制备式(II)，(IIA)，(IIB)，或(V)的中间体。例如
本发明的一个优选方法是方法b)。
应理解本发明化合物中不同环取代基中的某些可以在上述方法之前或进行中通过标准芳香取代反应引入，或者通过常规官能团修饰来生成，并且属于本发明的方法方面。此类反应和修饰包括，例如，通过芳香取代反应的方式引入取代基，取代基的还原，取代基的烷基化和取代基的氧化。这些过程的试剂和反应条件是化学领域中熟知的。芳香取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如酰基内鎓盐和路易斯酸(如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入酰基；用无机卤化物和路易斯酸(例如三氯化铝)在Friedel Crafts条件下引入烷基；和引入卤素基团。修饰的具体实例包括将硝基还原为氨基，通过例如用镍催化剂催化氢化或用铁在盐酸的存在下加热处理；烷硫基氧化为烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。
还应理解，一些上述反应可能必须/希望保护化合物中的敏感性基团。必须或希望保护的情况和适当的保护方法是所属领域熟知的。常规保护基可以按照标准实践使用(例如参见T.W.Green，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，1991)。所以，如果反应物包括基团如氨基、羧基或羟基，可能希望在上述某些反应中将其保护起来。
适合氨基或烷基氨基的保护基是，譬如酰基，例如烷酰基，如乙酰基；烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基或叔丁氧基羰基；芳基甲氧基羰基，例如苄氧基羰基；或芳酰基，例如苯甲酰基。上述保护基的脱保护条件必须根据选择的保护基来变化。所以，例如，酰基如烷酰基或烷氧基羰基或芳酰基可以通过，譬如用适当碱如碱金属氢氧化物水解来脱除，例如氢氧化锂或氢氧化钠。或者，酰基如叔丁氧基羰基可以通过例如用适当酸处理来脱除，所述的酸例如是盐酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸；并且芳基甲氧基羰基如苄氧基羰基可以通过例如在催化剂如碳载钯的作用下氢化来脱除，或者通过用路易斯酸如三(三氟乙酸)化硼处理来脱除。适合伯氨基的其它适当保护基是例如，邻苯二甲酰基，其可以通过用烷基胺(如二甲基氨基丙胺)或用肼处理来脱除。
适合巯基的保护基是，譬如，酰基，例如烷酰基，如乙酰基；芳酰基，例如苯甲酰基；或芳基甲基，例如苄基。上述保护基的脱保护条件必须根据选择的保护基来变化。所以，例如，酰基如烷酰基或芳酰基可以通过例如用适当碱水解来脱除，所述的碱例如是碱金属氢氧化物，如氢氧化锂或氢氧化钠。同样地芳基甲基如苄基可以通过例如用催化剂如碳载钯氢化来脱除。
适合羧基的保护基是，譬如，酯化基团，例如甲基或乙基，其可以通过例如用碱(如氢氧化钠)水解来脱除；或叔丁基，其可以通过例如用酸处理来脱除，所述的酸例如是有机酸如三氟乙酸；或例如苄基，其可以通过例如用催化剂(如碳载钯)氢化来脱除。
保护基可以在合成中的任何常规阶段用化学领域熟知的常规技术来脱除。
在此定义的许多中间体是新的，例如式II和IV的那些化合物，这些化合物是本发明的另一特征。试验
如上所述本发明定义的嘧啶类衍生物具有抗细胞增殖活性，例如抗癌活性，其被认为是由化合物的CDK和/或FAK抑制作用产生的。这些特性可以利用例如下列方法进行评估CDK4抑制试验
使用下列缩写-HEPES是N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)DTT是二硫苏糖醇PMSF是苯基甲基磺酰氟
所述的化合物在体外激酶试验中于96孔格式内利用闪烁亲近测定法(SPA-得自Amersham)测定掺混在试验底物(GST-成视网膜细胞瘤)中的[γ-33-P]-三磷酸酰苷。在各孔中加入试验化合物(在DMSO和水中稀释至适当浓度)并且在对照孔中或者加入p16作为抑制剂对照或者加入DMSO作为阳性对照。
将约0.5μl的在25μl培养缓冲液中稀释的CDK4/细胞周期蛋白D1部分纯化的酶(用量取决于酶的活性)加入到各孔中，随后加入2μl的GST-Rb/ATP/ATP33混合物(含有0.5μg GST-Rb和0.2μM ATP和0.14μCi[γ-33-P]-三磷酸腺苷)，并且轻轻振摇所得的混合物，此后在室温下温育60分钟。
随后向各孔加入150μL终止溶液，其含有(0.8mg/孔的蛋白A-PVTSPA珠(Amersham))，20μM/孔的抗谷胱甘肽转移酶，兔IgG(得自Molecular Probes)，61mM EDTA和50mM的含0.05％叠氮化钠的HEPESpH7.5。
平板用Topseal-S平板密封层密封，放置2小时，进而在2500rpm，1124xg.下旋转5分钟。该平板在Topcount上每孔读取30秒。
用来稀释酶和底物混合物的培养缓冲液含有50mM HEPES pH7.5，10mM MnCl2，1mM DTT，100μM钒酸钠，100μM NaF，10mM甘油磷酸钠，BSA(最终为1mg/ml)。
作为对照，可以用CDK4的另一种已知抑制剂代替p16使用。试验底物
在本试验中只使用部分的成视网膜细胞瘤(Science 1987 Mar13；235(4794)1394-1399；Lee W.H.，Bookstein R.，Hong F.，YoungL.J.，Shew J.Y.，Lee E.Y.)，与GST tag融合。进行成视网膜细胞瘤氨基酸379-928的PGR(得自成视网膜细胞瘤质粒ATCC pLRbRNL)，并且此后克隆到pGEX 2T融合载体(Smith D.B.和Johnson，K.S.Gene67，31(1988)；其含有诱导表达的tac启动子，内lac Iq基因用于任何大肠杆菌宿主，和凝血酶裂解的编码区-得自Pharmacia Biotech)中，用它来扩增氨基酸792-928。将这个序列重新克隆在pGEX 2T中。
利用标准诱导表达技术将由此得到的成视网膜细胞瘤792-928序列表达在大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS细胞)中，并且按照下面方法纯化。
使大肠杆菌糊悬浮在10ml/g的NETN缓冲液(50mM Tris pH7.5，120mM NaCl，1mM EDTA，0.5％v/v NP-40，1mM PMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml胃蛋白酶抑制剂)中并将每100ml匀浆超声处理2×45秒。离心后，取上清液加载到10ml谷胱甘肽琼脂糖柱(Pharmacia Biotech，Herts，UK)上，并且用NETN缓冲液洗涤。用激酶缓冲液(50mM HEPES pH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM PMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽，1ug/ml抑肽酶和1ug/ml胃蛋白酶抑制剂)洗涤之后用50mM存在于激酶缓冲液中的还原型谷胱甘肽洗脱出蛋白。合并含有GST-Rb(792-927)的馏分且相对于激酶缓冲液透析过夜。终产物通过十二烷基硫酸钠(SDS)PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)、利用8-16％ Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，USA)纯化。CDK4和细胞周期蛋白D1
CDK4和细胞周期蛋白D1由MCF-7细胞系从RNA(得自ATCC数HTB22，乳腺癌系)按照下列方法克隆。从MCF-7细胞制备RNA，随后用低聚dT引物逆转录。用PGR扩增各基因的整个编码序列[CDK4氨基acids 1-303；Ref.Cell 1992 Oct 16；71(2)323-334；MatsushimeH.，Ewen M.E.，Stron D.K.，Kate J.Y.，Hanks S.K.，Roussel M.F.，Sherr C.J.& Cyclin D1氨基acids 1-296；Ref.Cold SpringHarb.Symp.Quant.Biol.，1991；5693-97；Arnold A.，MotokuraT.，Bloom T.，Kronenburg，Ruderman J.，Juppner H.，KimH.G.]。
序列化后用标准技术将PCR产物克隆到昆虫表达载体pVL1393(得自Invitrogen1995目录号V1392-20)中。PCR产物随后二元表达[用标准病毒Baculogold共感染技术]在昆虫SF21细胞体系(Spodoptera Frugiperda细胞衍生自Fall Army Worm的卵巢细胞-市售)。
下列实施例提供了在对于各病毒的细胞周期蛋白D1 & CDK4具有双重感染MOI3的SF21细胞中制备细胞周期蛋白D1/CDK4(在TC100+10％FBS(TCS)+0.2％Pluronic中)的详细内容。细胞周期蛋白D1/CDK4的制备实例
在滚瓶培养物中生长至2.33×106细胞/ml的SF21细胞以0.2×10E6细胞/ml接种在10×500ml滚瓶中。滚瓶在滚架上28℃下温育。
3天(72小时)后对细胞计数，并且发现2瓶的平均值是1.86×10E6细胞/ml(99％成活)。随后该培养物用双重病毒以MOI3对各个病毒进行感染。
10×500ml用JS303细胞周期蛋白D1病毒滴度-9×10E7pfu/ml.JS304 CDK4病毒滴度-1×10E8 pfu/ml感染。细胞周期蛋白D1病毒/个500ml瓶CDK4病毒/个500ml瓶
病毒在加入之前与培养物混合，并且把培养物重新置于28℃的滚架上。
3天(72小时)后感染之后收获5L的培养物。收获的总细胞数为1.58×10E6细胞/ml.(99％成活)。使细胞在2500rpm和4℃下在Heraeus Omnifuge 2.0RS中旋转30分钟，一个批次为250ml。弃去上清液。20团的～4×10E8细胞/团在LN2中急速冷冻并喜爱-80℃储藏在CCRF冰室中。随后SF21细胞通过悬浮在裂解缓冲液(50mMHEPES pH7.5，10mM氯化镁，1mM DTT，10mM甘油磷酸，0.1mM PMSF，0.1mM氟化钠，0.1mM原钒酸钠，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml亮抑蛋白酶肽和20％w/v蔗糖)中在低渗下溶解，并且加入冰冷的去离子水。离心后，将上清液加载在Poros HQ/M 1.4/100离子交换柱(PEBiosystems，Hertford，UK)上。CDK4和细胞周期蛋白D1用375mM存在于裂解缓冲液中的NaCl共洗脱，并且通过蛋白质印迹法利用适当的抗CDK4和抗-细胞周期蛋白D1抗体(得自Santa CruzBiotechnology，California，US)检测这两者的存在。p16对照(Nature 366.704-7071993Serrano M.HannonGJ.Beach D)
p16(CDK4/细胞周期蛋白D1的天然抑制剂)由HeLa cDNA(Hela细胞得自ATCC CCL2，人上皮样癌源自子宫颈；Cancer Res.12264，1952)扩增，克隆到pTB375 NBSE中，其具有5′His tag，并且用标准技术转化到BL21(DE3)pLysS细胞(得自Promega；Ref.Studier F.w.&Moffat B.A.，J.Mol.Biol.，189，113，1986)。使1L培养物生长至适当OD，随后用IPTG诱导以过夜表达p16。细胞此后通过在50mM磷酸钠，0.5M氯化钠，PMSF，0.5μg/ml亮抑蛋白酶肽和0.5μLg/ml抑肽酶中超声来裂解。旋转该混合物，取上清液加入到镍螯合珠粒并混合1/2小时。该珠粒用磷酸钠，NaCl pH6.0洗涤且p16产物用200mM咪唑洗脱到磷酸钠，NaCl pH7.4中。
pTB NBSE由pTB375 NBPE按照下列方法构建-pTB375
用来产生pTB375的背景载体是pZEN0042(参见UK专利2253852)并含有质粒pKS492的tetA/tetR诱导四环素耐药序列和pAT153衍生背景中的cer稳定性序列。通过加入由T7基因10启动子、多克隆位点和T7基因10终止序列组成的过度表达盒生成pTB375。此外，设计减少从背景载体转录连读的终止子序列包括该表达盒的上游。pTB375 NBPE
除去pTB375中存在的独特EcoRI限制位点。将含有限制酶NdeI，BamHI，PstI和EcoRI的识别序列的新多克隆位点引入到pTB375中位于NdeI和BamHI位点之间，破坏pTB375中原始的BamHI位点。pTB375 NBSE
将含有限制酶NdeI，BamHI，SmaI和EcoRI的识别序列的新多克隆位点引入到pTB375 NBPE中位于NdeI和EcoRI位点之间。含有这些限制位点的寡核苷酸也含有位于同一读框内NdeI和BamHI位点之间的6个组氨酸密码子，作为起始密码子(ATG)存在于NdeI位点。
通过类似方法，可以构思设计评估CDK2和CDK6抑制作用的试验。CDK2(EMBL Accession No.X62071)可以与细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白E(参见EMBL Accession No.M73812)一起使用，而此类试验的其它详细内容包括在PCT国际专利公开号WO99/21845中，其有关的生物化学和生物评估部分在此引入作为参考。
如果使用CDK2和细胞周期蛋白E按照下面方法可以获得部分共纯化的使Sf21细胞重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris pH8.2，10mMMgCl2，1mM DTT，10mM甘油磷酸盐，0.1mM原钒酸钠，0.1mM NaF，1mMPMSF，1ug/ml亮抑蛋白酶肽和1ug/ml抑肽酶)并在10ml Douncehomgeniser中均化2分钟。离心后，将上清液加载在Pores HQ/M1.4/100离子交换柱(PE Biosystems，Hertford，UK)上。CDK2和细胞周期蛋白E在0-1M NaCl梯度液(在裂解缓冲液中洗脱但减去蛋白酶抑制剂)开始后约20个柱体积时被共同洗脱出来。共洗脱液通过蛋白质印迹利用抗-CDK2和抗-细胞周期蛋白E两种抗体(Santa CruzBiotechnology，California，US)检测。FAK3激酶抑制试验
该试验测定试验化合物抑制人粘着斑激酶(FAK)的人酪氨酸激酶活性的能力。
通过全基因合成得到DNA编码的FAK(Edwards M，InternationalBiotechnology Lab 5(3)，19-25，1987)或者通过克隆得到。它们随后被表达在适当的表达体系中来获得具有酪氨酸激酶活性的多肽。例如，通过重组蛋白在昆虫细胞中的表达得到的FAK被发现具有内在酪氨酸激酶活性。
修饰FAK(全长人cDNA，其由Andre等描述在(Biochemical andBiophysical Research Communications，1993，190(1)140-147；EMBL/GenBank Accession Number L05186))使所得的蛋白在翻译时在N末端直接在起始甲硫氨酸之前具有6-组氨酸tag。活性FAK蛋白早已用相似的N末端6-组氨酸tag表达在杆状病毒体系中(ProteinExpression and Purification，1996，712-18)。将人FAK cDNA克隆到杆状病毒置换型载体pFastbac 1(Life Technologies)中，并且将重组构建共转染到具有病毒DNA的昆虫细胞中(例如草地夜蛾21(Sf21))以制备重组杆状病毒(重组DNA分子的装配方法及重组杆状病毒的制备和使用方法的详细内容可以参见标准著作，例如Sambrook等，1989，Molecular cloning-A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press和O′Reilly等，1992，Baculovirus Expression Vectors-A Laboratory Manual，W.H.Freeman & Co，New York.有关pFastbac(′Bac to Bac′)体系的使用的详细内容由Anderson等在1995，FOCUS(Life TechnologiesBulletin Magazine)，17，p53.中提供)。
为了生物活性人体FAK蛋白的表达，Sf21细胞用噬斑纯FAK重组表达以感染复数3感染且在48小时后收获。收获的细胞用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)(10mM磷酸钠pH7.4，138mM氯化钠，2.7mM氯化钾)洗涤，随后重新悬浮在冰冷的裂解缓冲液(50mM HEPES pH7.5，1mM二硫苏糖醇，100uM氟化钠，100uM原钒酸钠，10mM甘油磷酸盐，100uM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，5ug/ml抑肽酶，5ug/ml亮抑蛋白酶肽，1％吐温；在使用之前即时从新制的存在于甲醇中的100mM溶液取出PMSF加入其中)中，每10百万个细胞使用250μl裂解缓冲液。该混悬液随后在冰上温育15分钟并在4℃和13,000rpm下离心10分钟。取上清液(酶储备液)且制成等份试样，将它们在液氮中速冻并随即储藏在-70℃下。对于典型皮子，储备酶用酶稀释液1∶250稀释((100m HEPES pH7.4，0.2mM二硫苏糖醇，200uM原钒酸钠，0.1％Triton X-100)并且在各试验孔中使用50ml新稀释的酶(参见FAK3方案，下文)。FAK3体外酶试验方案
由含有酪氨酸的无规共聚物制备底物溶液的储备液，例如聚(Glu，Ala，Tyr)6∶3∶1(Sigma P3899)，作为存在于PBS中的1mg/ml储备液储藏在-20℃下并用PBS1500稀释用于平板包被。
在试验前一天将100μl的稀释底物溶液分散到试验平板的各孔中(Maxisorp 96孔免疫平板Life technologies，Cat.No.439454A)，其用平板密封层密封并在4℃下放置过夜。
在试验当天弃去底物溶液且试验平板用200μlPBST(PBS含有0.05％ v/v吐温20)洗涤一次并用200μl 50mM Hepes pH7.4洗涤一次。
在DMSO中将试验化合物制成10mM或30mM储备液，随后进一步在玻璃蒸馏水中稀释直至稀释到比最终试验浓度高10倍以上的浓度。取10μl的稀释化合物转移到洗涤试验平板的孔中。″无化合物″对照孔含有10μl玻璃蒸馏水代替化合物。
将40微升的含有6.25μM 5′-三磷酸腺苷(ATP)的25mM氯化锰加入到全部试验孔中。为了开始反应将50μl的新稀释酶加入到各孔中，并且平板在23℃下温育90分钟。随后加入100μl的含20mM EDTA的PBS终止该反应。此后弃去液体并且孔用PBST洗涤2次。
取100微升的小鼠HRP-连接的抗-磷酰酪氨酸抗体(Santa Cruz，Product SC 7020-HRP)加入到各孔中，该抗体用PBST 1∶1500稀释且所述的PBST含有0.5％w/v牛血清白蛋白(BSA)，平板在室温下温育1小时，随后弃去液体并用200μlPBST洗涤2次。向各孔中加入100微升的2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)溶液，该溶液是用一个50mg ABTS片(Boehringer 1204 521)在50ml新制的50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH5.0+0.03％过硼酸钠(每100ml蒸馏水用1磷酸盐柠檬酸盐缓冲液和过硼酸钠(PCSB)胶囊(Sigma P4922)制备)中新制成。随后平板在室温下温育20-60分钟直至“无化合物”对照孔的吸光度值在405nm下用平板读取分光光度计测定达到约1.0为止。
剂量反应曲线是由Origin软件读取的吸光度获得。利用由Origin软件分析确定的半数抑制浓度(IC50)排列化合物。
虽然式(I)的化合物的药理学性质随结构的改变而变化，但式(I)的化合物在上述试验中所具备的一般活性可以在IC50浓度或剂量上证实在250μM-1nM。
当在上述体外试验中测试时实施例13的CDK4抑制活性测定出是IC50＝0.896M。当在上述体外试验中测试时实施例14的FAK抑制活性测定出是IC50＝0.366μM。
本发明的化合物的体内活性可以通过标准技术来评估，例如通过测定细胞生长的抑制作用并评估细胞毒性。譬如，进一步详情可以参见下列参考文献a)Attenution of the Expression of the Focal Adhesion kinaseinduces Apoptosis in Tumor Cells.Xu L-h等.Cell Growth &Differentiation(1996)7，p413-418；b)The COOH-Terminal Domain of the Focal Adhesion kinaseInduces Loss of Adhesion and Cell Death in Human TumourCells.Xu L-h等.Cell Growth & Differentiation(1998)9，p999-1005；c)Inhibition of pp125-FAK in Cultured Fibroblasts Results inApoptosis.Hungerford J.E等.The Journal of CellBiology(1996)135，p1383-1390；d)Inhibition of Focal Adhesion Kinas(FAK)Signalling in FocalAdhesions Decreases Cell Motility and Proliferation.GilmoreA.P和Romer L.H.Molecular Biology of the Cell(1996)7，p1209-1224.
细胞生长的抑制作用可以通过用硫氰酸胺B(SRB)将细胞染色，这是一种可以使蛋白染色荧光染料，由此测定孔中蛋白(即细胞)的量(参见Boyd，M.R.(1989)Status of the NCI preclinical antitumourdrug discovery screen.Prin.Prac Oneol 101-12)。所以，下面详述了测定细胞生长的方法
将细胞铺板96孔平板中体积为100μl的适当培养基内；培养基是Dulbecco改进的Eagle培养基用于MCF-7，SK-UT-1B和SK-UT-1。令细胞附着过夜，随后加入不同浓度的抑制剂化合物，DMSO的最大浓度为1％(v/v)。测定对照平板得出给药之前的细胞的值。细胞在37℃(5％CO2)下温育3天。
3天结束后将TCA加入到平板中使终浓度为16％(v/v)。此后平板在4℃下温育1小时，除去上清液且平板用自来水冲洗。干燥后，加入100μl SRB染料(0.4％ SRB存在于1％乙酸中)在37℃下保持30分钟。除去过量的SRB且平板在1％乙酸中洗涤。
结合蛋白的SRB溶解在10mM Tris pH7.5中并在室温下振摇30分钟。在540nm下读取ODs，和由抑制剂浓度和吸光度的半对数曲线测定出抑制剂引起50％生长抑制率的浓度。化合物使光密度减小到低于细胞在试验开始时铺板所得到的光密度的浓度给出了毒性数值。
当在SRB试验中测试时本发明化合物的典型IC50是在1mM-1nM的范围内。
按照本发明的另一方面，提供了一种药物组合物。其含有定义如上的式(I)嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯，以及有关的药学可接受稀释剂或载体。
所述的组合物可以是收获口服给药的形式，例如片剂或胶囊；或者非肠道注射的形式(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)成为灭菌溶液、混悬液或乳液；局部给药的形式，如软膏或霜剂；或用直肠给药，成为栓剂。
通常，上述组合物可以以常规方式用常规赋形剂制备。
所述的嘧啶可以以单位剂量施用给温血动物，该单位剂量是在5-5000mg/平方米动物身体面积，也就是约0.1-100mg/kg，并且这一般提供一个治疗有效剂量。单位剂型如片剂或胶囊常常含有例如1-250mg的活性成分。
优选日剂量采用1-50mg/kg的范围。然而，日剂量必须根据被治疗的宿主、具体给药途径和被治疗疾病的严重性来变化。所以，最佳剂量可以由治疗具体患者的医师来决定。
按照本发明的另一方面提供定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯应用于一种预防或治疗温度动物(包括人体)的方法中。
我们发现本发明定义的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯，是有效的细胞周期抑制剂(抗细胞增殖药物)，该性质(不受理论的约束)被认为是由其CDK抑制特性产生的。所述的化合物也是FAK的有效抑制剂。所以，本发明的化合物被认为可以适用于单独或部分通过CDK和/或FAK酶介导的疾病或医学病症的治疗中，即所述的化合物可以用来在需要该治疗的温血动物中产生CDK和/或FAK抑制效果。因此本发明的化合物提供了一种治疗恶性细胞的增殖和/或转移的方法，该方法的特征在于通过抑制CDK和/或FAK酶，也就是所述的化合物可以单独或部分通过抑制CDKs和/或FAK介导来产生抗增殖/转移效果。所述的化合物也可以通过诱导细胞死亡(细胞凋亡)用作FAK抑制剂。由此本发明的嘧啶类衍生物被认为具有广泛的抗癌特性，因为CDKs和/或FAK涉及多种常见人体癌症，例如白血病和乳腺、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、胰腺和卵巢癌。所以认为本发明的嘧啶类衍生物具有对这些癌症的抗癌活性。此外还期望本发明的嘧啶类衍生物对多种白血病、淋巴样恶性肿瘤和实体瘤具有活性，例如组织如肝脏、肾脏、前列腺和胰腺中的癌症和肉瘤。特别是本发明所述的化合物有利地减缓例如结肠、乳腺、前列腺、肺和皮肤的原发性和复发性实体瘤的生长。更加具体地，本发明的化合物，或其药学可接受盐或体内可水解酯，能够抑制与CDK和/或FAK有关的原发性和复发性实体瘤的生长，尤其是那些其生长和扩散明显有利于CDK和/或FAK的肿瘤，包括例如某些结肠、乳腺、前列腺、肺、外阴和皮肤的肿瘤。
进一步期望本发明的嘧啶类衍生物在广泛的其它疾病状况中具有对抗其它细胞增殖/转移性疾病的活性，包括白血病、纤维性增殖性和分化性失调、牛皮癣、风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、粉瘤、动脉粥样硬化、动脉再狭窄、自身免疫性疾病、急性和慢性炎症、骨疾病和具有视网膜血管增生的眼疾病。
所以按照本发明的这个方面提供了定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯用作药物；和定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯在制备药物中的应用，所述的药物用于在温血动物如人体中产生抗癌、细胞周期抑制(抗细胞增殖)效果和/或FAK抑制(抗细胞转移和/或细胞凋亡诱导)效果。特别是，细胞周期抑制在于是在S或G1-S期通过对CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6的抑制来产生的。
按照本发明的另一方面，提供一种在需要该治疗的温血动物(如人体)中产生抗癌、细胞周期抑制(抗细胞增殖)效果和/或FAK抑制(抗细胞转移和/或细胞凋亡诱导)效果的方法，该方法包括给该动物施用有效量的定义如上的嘧啶类衍生物。具体而言，通过抑制CDK2、CDK4和/或CDK6，尤其是CDK4和CDK6在S或G1-S期产生抑制效果。
如上所述，治疗性或预防性出来具体细胞增殖性疾病所需要的剂量的多少必须根据被治疗宿主、给药途径和被治疗疾病的严重性来变化。单位剂量是在例如1-100mg/kg的范围内，有优选1-50mg/kg。
上面定义的CDK和/或FAK抑制活性可以应用作为单一疗法，或者除了本发明的化合物以外可以包括一种或多种其它物质和/或治疗。可以通过同时、连续或分开施用治疗的各个组分来获得这样的联合治疗。在医学肿瘤学的领域中，正常实践采用不同形式的治疗的联合形式来治疗各个癌症患者。在医学肿瘤学中，这种联合治疗的其它组成部分除了此处定义的细胞周期抑制治疗之外可以是手术、放疗或化疗。所述的化疗可以包括三种主要治疗剂(i)其它细胞周期抑制剂，其通过与上面定义的相同或不同的机理工作；(ii)细胞抑制剂如抗雌激素类(例如他莫昔芬、托瑞米粉、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘昔芬(iodoxyfene))，孕激素类(例如醋酸甲地孕酮)，芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(anastrozole)，来曲唑，伏氯唑，依西美坦)，抗孕激素，抗雄激素(例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺，环丙孕酮醋酸酯)，LHRH激动剂和拮抗剂(例如醋酸戈舍瑞林、luprolide)，睾酮5α-二氢还原酶的抑制剂(例如非那司提)，抗侵入剂(例如金属蛋白酶抑制剂，如马立司特(marimastat)和尿激酶纤溶酶原激活剂受体功能的抑制剂)和生长因子功能的抑制剂，(所述的生长因子包括例如血小板衍化生长因子和肝细胞生长因子，此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)；和(iii)在医学肿瘤学中使用的抗增殖/抗肿瘤药物及其联合形式，例如抗代谢物(例如叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤，氟嘧啶类，如5-氟尿嘧啶、嘌呤和腺苷类似物，阿糖胞苷)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素和伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素D、光辉霉素)；铂衍生物(例如顺铂、卡铂)；烷化剂(例如氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、噻替派)；抗有丝分裂药(例如长春花生物碱如长春新碱和紫杉生物碱如紫杉酚、taxotere)；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊甙和替尼泊甙、安吖啶、托泊替堪(topotecan))。按照本发明的这个方面，提供一种药物产品，其含有A定义如上的式(I)的嘧啶类衍生物，或其药学可接受盐或体内可水解酯，和附加的上述抗肿瘤物质用于癌症的联合治疗。还可以给予有效的止吐药，譬如当使用上述联合治疗时。
除了其治疗药物以外，式(I)的化合物及其药学可接受盐在体外和体内试验体系中是用于评估细胞周期活性的抑制剂在试验动物(如猫、狗、兔、猴子、大鼠和小鼠)中的效果的药理学工具，成为寻找新治疗药物的部分。
在上述其它药物组合物、过程、方法、使用和药物制造特征中，本发明的其它和优选实施方式将在此描述。
本发明现在以下列非限定实施例举例说明，其中标准技术是专业化学技术人员已知的且可以适当采用与这些实施例描述的相类似的那些技术。并且其中除非另外说明(i)蒸发是提供旋转蒸发在真空下下进行，并且处理方法是在除去残余固体如通过过量除去干燥剂之后进行；(ii)操作是在常温下进行，一般是在18-25℃和大气中进行，除非另外说明，或者除非专业人员在惰性气体如氩气下进行同样操作；(iii)柱层析(通过快速层析法)和中压液体色谱(MPLC)是在MerckKieselgel硅胶(Art.9385)或在Merck Lichroprep RP-18(Art.9303)反相硅胶上进行，其得自E.Merck，Darmstadt，Germany；结合洗脱色谱利用Varian Mega Bond Elut cartridges(10g，order code1225-6034)进行，得自Varian Sample Preparation Products，California，USA；(iv)收率仅仅是举例说明并且不一定是可得到的最大收率；(v)式(I)的终产物的结构一般是通过核(一般是质子)磁共振(NMR)和质谱技术来验证；质子核磁共振化学位移值是在氘化DMSO-d6中(除非另外说明)以δ刻度(四甲基硅烷的ppm低场)测定，测定时使用VarianGemini 2000光谱计在300MHz的场强下操作，或使用Bruker AM250光谱计在250MHz的场强下操作；和峰多重态表示如下s，单重峰；d，二重峰；dd，一对二重峰；t，三重峰；tt，三对三重峰；q，四重峰；tq，三对四重峰；m，多重峰；br，宽峰；质谱(MS)是通过电子喷射在VG平台上进行(vi)分析高效液相色谱(HPLC)是在Hypersil 10cm碱减活反相柱上进行，流量为2ml/分钟，在10分钟内用5-95％乙腈/水梯度液，在254nm的波长下检测，和数据表示为保留时间(RT)以分钟计；(vii)中间体一般不用全面定性，并且纯度是通过薄层层析(TLC)、HPLC、红外(IR)、MS或NMR分析法测定；(viii)其中溶液被干燥，干燥剂是硫酸镁；(ix)下列所需在上下文中使用
DCM二氯甲烷；
DMF N，N-二甲基甲酰胺；
DMSO二甲基亚砜；
NMP N-甲基吡咯烷-2-酮；
THF四氢呋喃。实施例15-溴-2-{4-[2-羟基-3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基]苯氨基}-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶
5-溴-2-氯-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶(方法1，200mg，0.63mmol)和4-[2-羟基-3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基]苯胺盐酸盐(方法8，156mg，0.56mmol)在NMP(4ml)中的溶液在100℃6小时。加入二氧化硅(1g)且通过蒸发除去挥发性物质。残余物通过柱层析纯化，用0-10％存在于DCM中的2.0M甲醇氨溶液DCM洗脱，得到产物，其为无色固体(173mg，56％).MS(MH+)489，491；HPLC(RT)4.68.实施例2-4
下列化合物按照类似于实施例1所述的方法制备，使用4-[2-羟基-3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基]苯胺盐酸盐(方法8)和适当的4，5-二取代的2-氯嘧啶(方法2-4)
1反应是在环丁砜中在150℃下进行并且通过用DCM稀释该反应混合物并加热盐酸醚溶液分离出产物，其为二盐酸盐。实施例55-溴-2-{4-[3-(异丁基氨基)-2-羟基丙氧基]苯氨基)-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶
将氯化氢乙醚溶液(2.0M；0.57ml，1.14mmol)加入到5-溴-2-氯-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶(方法1，200mg，0.63mmol)和4-[3(异丁基氨基)-2-羟基丙氧基]苯胺(方法10，136mg，0.57mmol)在NMP(4ml)中的溶液内。该溶液在100℃下加热6小时且加入二氧化硅(1g)。通过蒸发除去挥发性物质且残余物通过柱层析纯化，用0-10％存在于DCM中的2.0M甲醇氨溶液DCM洗脱，得到产物，其为无色固体(76mg，26％).MS(MH+)517，519；HPLC(RT)6.48。实施例6-10
下列化合物按照类似于实施例5所述的方法制备，使用5-溴-2-氯-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶(方法4)和适当的取代苯胺(方法11-15)
实施例11-13
下列化合物按照类似于实施例5所述的方法制备，使用2-氯-5-氟-4-(4-甲氧基苯氧基)嘧啶(方法4)和适当取代的苯胺(方法11、16或按照Pharmazie，1980，35，278所述得到)
实施例145-溴-2-{4-[2-羟基-3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基]苯氨基}-4-(苯硫基)嘧啶
使用与实施例1类似的方法，但从5-溴-2-氯-4-(苯硫基)嘧啶(方法6)和4-[2-羟基-3-(N，N-二甲基氨基)丙氧基]苯胺盐酸盐(方法8)开始，得到产物。NMR2.2(s，6H)，2.3(m，2H)，3.7(m，1H)，3.9(m，2H)，4.7(d，1H)，6.5(d，2H)，7.0(d，2H)，7.6(5H)，8.3(s，1H)，9.5(s，1H)；MS(MH+)475，477.实施例15-17
下列化合物按照类似于实施例5所述的方法制备，使用4-取代的5-溴-2-氯嘧啶(方法6-7)和适当的取代苯胺(按照Pharmazie，1980，35，278所述获得)
1Recorded in CDCl3起始原料的制备
上述实施例的起始原料或者商购或者很容易地通过标准方法由已知原料制备。譬如，举例说明上述反应所用的一些起始原料的下列反应，但不是限定。方法15-溴-2-氯-4-嘧啶
将5-溴-2，4-二氯嘧啶(5.0g，22.0mmol)，4-甲氧基苯酚(2.72g，22.0mmol)和碳酸钾(6.07g，44.0mmol)在DMF(20ml)中的混合物搅拌24小时。把该混合物加入到水(100ml)中，通过过滤收集分开的固体，用水(50ml)洗涤且在高真空下干燥，得到产物(6.6g，96％)。NMR3.8(s，3H)，7.0(d，2H)，7.2(d，2H)，8.8(s，1H)。方法2-4
下列中间体按照类似于方法1所述的方法制备，使用适当的酚和适当的2，4-二氯-5-卤代嘧啶(商购或按照方法5获得)
方法52，4，5-三氯嘧啶
将5-氯尿嘧啶(10.0g，68.5mmol)溶解在三氯氧化磷(60ml)并加入五氯化磷(16.0g，77.0mmol)。该混合物在回流下加热16小时，放置冷却，随后缓慢倾入水(200ml)中通式剧烈搅拌。搅拌该混合物1.5小时，随后加入乙酸乙酯(250ml)。分离有机层，水层用另外部分的乙酸乙酯(250ml)提取。合并的提取液用饱和碳酸氢钠(200ml)和饱和氯化钠溶液(200ml)洗涤，随后干燥。通过蒸发除去挥发性物质和残余物通过柱层析纯化，用DCM洗脱，得到产物，其为黄色用途(6.37g，51％).NMR(CDCl3)8.62(s，1H)；MS(MH+)182，184，186.方法65-溴-2-氯-4-(苯硫基)嘧啶
利用类似于上述方法1的方法，但从5-溴-2，4-二氯嘧啶和硫代苯酚起始，得