专利名称：一种银杏内酯b粉针剂及其制备方法 血小板活化因子(PAF)是一种重要的炎症介质，也是多种疾病发病的介质之一。病理研究表明PAF在过敏、溃疡、哮喘、血栓形成、炎症、器官移植排斥、内毒素导致的休克等过程中起着重要作用。银杏总内酯是从银杏叶内提取的有效成分银杏内酯A、B、C及白果内酯的组合物，是一类较强的植物提取物血小板活化因子拮抗剂。研究表明，其中，银杏内酯B是活性最强的血小板活化因子拮抗剂。银杏内酯B的结构式为 银杏内酯B银杏内酯B难溶于水，不仅使其不易被分离提纯，而且将其制成注射剂等剂型也比较困难，主要体现在在吸收效果及生物利用率、产品的稳定性上难以获得理想的实用效果。目前国内外对银杏叶类产品进行了许多研究并有临床使用，如德国的Ginaton、法国的Tanakan，中国药典2005版中药部亦收载了银杏叶、银杏提取物及银杏叶片等品种，但是均为含有混合的银杏内酯A、B、C及白果内酯，目前尚未有单一的银杏内酯B产品上市，国内也没有银杏内酯B产品进入临床研究阶段。在实验过程中发现银杏内酯B开环成盐后溶解性确实增加，有利于制成水溶性制剂。在中国专利文献CN1472214A中就公开了这样一种方法，是利用含氮有机物与银杏内酯B复合成银杏内酯B复合物，其中含氮有机物以精氨酸、赖氨酸或葡甲胺为佳。采用这种方法虽然能够解决银杏内酯B的水溶性问题，但是药物的稳定性下降，例如银杏内酯B与葡甲胺(1∶0.8～1.2)开环成盐的样品对热敏感，较难在常温下保存，需要低温(10℃以下)保存才能够维持药品的稳定性；并且采用这方法生产工艺比较复杂，且因含氮有机物的价格较高的原因也增加了药品的生产成本。上述技术问题均限制了这种方法在现实中的应用。
本发明的目的在于提供一种新型的银杏内酯B粉针剂，在解决银杏内酯B的水溶性问题时，又能够解决药物的稳定性问题。本发明的另一个目的还在于提供一种所述银杏内酯B粉针剂的制备方法，这种方法工艺简单，生产成本低。为了实现本发明的第一个目的，采用如下技术方案一种银杏内酯B粉针剂，是由主药和助溶剂及赋形剂制成的粉针剂，所述主药的基本组成为银杏内酯B，助溶剂为碳酸钠、丙二醇，按重量计其重量比是银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶1～2∶1～10。优选比例为银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶1∶3针对银杏内酯B的理化性能及剂型，赋形剂可以为右旋糖酐40、乳糖、甘露醇中的一种或几种。
由于银杏内酯B提纯比较困难，获得纯的银杏内酯B单体成本很高，因此所述的主药中银杏内酯B的重量含量要求是大于90％，另外还可以含有少量的银杏内酯A。
本发明提供的这种银杏内酯B粉针剂的制备方法为将银杏内酯B原料与碳酸钠、丙二醇按重量比为1∶(1～2)∶(1～10)的比例混合均匀，加注射用水溶解，往该溶液中加入占总重量比为50％～80％的赋形剂，使之溶解，用截流分子量为0.8～3万Dolton的膜超滤，除去热源，最后用滤膜过滤除菌，分装，预冻与干燥，轧盖，得银杏内酯B粉针剂成品。
所述的赋形剂可以为右旋糖酐40、乳糖、甘露醇中的一中或几种。
所述的过滤除菌过程中的滤膜可以为0.22μm的滤膜。
本发明利用少量的碳酸钠成盐和丙二醇增溶，解决了银杏内酯B难溶问题和稳定性问题，使得本发明所提供的银杏内酯B粉针剂具有较好水溶性和稳定性，药品有效成分可直接进入血液，生物利用度高。这种粉针剂具有抗过敏、抗炎、抗休克的特性，可抑制血小板聚集，减少血栓形成，对治疗心脑血管系统疾病等提供一种较好的药物制剂。本发明所提供的银杏内酯B粉针剂的组成及制备方法工艺简单，不使用有毒有害的有机溶剂，使用超滤法过滤减少药品被吸附的损失，工艺成本低，另外所用原料碳酸钠为12元/kg，丙二醇为8元/kg，相对于600元/kg的葡甲胺，可以降低产品成本。
对于本发明的银杏内酯B粉针剂的水溶性和稳定性，发明人进行了下述试验一、溶解度试验本发明的银杏内酯B粉针剂与银杏内酯B溶解于注射用水的溶解性能对比数据见表1表1本发明的银杏内酯B溶液澄清度检测对比结果

表1表明，本发明的银杏内酯B粉针剂溶解度好，符合注射剂要求。
二、稳定性考察稳定性试验的目的是考察药物在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。由于本发明的银杏内酯B粉针剂中所含有成分明确，纯度较高，故参考ICH中有关要求进行试验，本发明方法产品的稳定性试验均参照质量研究部分的试验条件。
试验所用银杏内酯B粉针剂试样的主要成分为银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶1∶3。
1、影响因素实验1)、高温试验取本发明的银杏内酯B粉针剂，于60℃的环境中放置10天，分别于第5天和第10天取样，按考察项目进行检测，与0天测定结果比较，本品的性状变为黄色块状物，溶液的颜色及含量均有所变化，所以改为高温40℃条件下试验，结果见表2表2高温40℃试验测定结果

银杏内酯B粉针剂经高温40℃考察10天，性状有所改变、含量略有下降，应阴凉处保存；pH值、澄明度、有关物质与0天相比无明显变化。
2)、强光照射试验取本品，置于可调光照箱中，在照度为4500Lx±500Lx的条件下放置10天，分别于第5天和第10天取样，按上述考察项目进行检测，与0天测定结果比较，测定结果见下表3。
表3强光试验测定结果

银杏内酯B粉针剂经强光照射考察10天，本品的含量略有下降，其他各项考察指标无明显变化。
3)、高湿试验取本品适量于敞口称量瓶中，置相对湿度为92.5％的恒湿密闭容器中放置10天，分别于第5天和第10天取样，按上述考察项目进行检测，与0天测定结果比较，测定结果下表4。
表4高湿试验测定结果

银杏内酯B粉针剂经高湿试验考察10天，本品的含量略有下降，其他各项考察指标基本稳定。
2、加速试验加速试验的目的是通过使用超常的贮存条件加速药物的化学降解或物理变化，探讨药物的稳定性，为药品审评、包装、运输及贮存提供必要的资料，其试验方法如下取本品三批，按市售所需条件包装，于温度为40±2℃、相对湿度为75±5％的条件下考察，外观性状变为淡黄色疏松块状物、含量有所下降，所以将考察条件改为温度为25±2℃、相对湿度为60±10％放置6个月，分别于0、1、2、3、6月末取样一次，按重点考察项目进行测定，结果见下表5。
表5银杏内酯B粉针剂加速试验测定结果


试验表明三批样品的含量稍有降低，其他考察项目均无明显变化。
3、长期试验取本品在温度为6℃±2℃、相对湿度RH60％±10％的条件下放置12个月，在试验期间分别于第3个月、6个月、9个月、12个月末取样进行检测(12个月以后继续考察，按时取样进行检测，以确定本品的最终有效期)，与0月数据比较。试验表明三批样品的外观性状、细菌内毒素、可见异物、pH值、均无明显变化，含量略有下降。测定结果见下表5。
表5银杏内酯B粉针剂三批样品长期试验测定结果

4、考察结论试验结果表明，按市售包装的银杏内酯B粉针剂在高温度影响下，药品的性状会发生改变，含量有所下降，光线影响的条件下含量略有下降；于加速试验条件(温度为40±2℃、相对湿度为75±5％)考察，外观性状变为淡黄色疏松块状物、含量有所下降，所以将考察条件改为温度25℃±2℃、相对湿度RH60％±10％考察了6个月，于长期试验条件(6℃±2℃、相对湿度RH60％±10％)下考察了12个月，含量下降但仍在合格范围内，其它各项指标均无明显变化；有效期暂定为2年。长期试验仍继续进行，结果将按有效期确定的统计分析方法来确定本品的最终有效期。
对银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶2∶6，以及为1∶2∶10进行了相同条件下的试验，其含量下降仍在合格范围内，但由于碳酸钠及丙二醇用量增加会使产品成本增加。
综上所述，本品贮藏条件为密闭，避光，置阴凉处(20℃以下)；有效期暂定为二年。
药效学试验试验所用银杏内酯B粉针剂试样的主要成分为银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶1∶3。
1、银杏内酯B粉针剂对大鼠局灶性脑缺血的影响取雄性大鼠70只，体重180-220g，随机分为7组，分别为假手术对照组；脑缺血模型组；银杏内酯B粉针剂小剂量组9mg/kg；银杏内酯B粉针剂中剂量组18mg/kg；银杏内酯B粉针剂大剂量组36mg/kg(以上3组均为静脉给药)；银杏内酯B粉针剂灌胃给药对照组灌胃给药18mg/kg；金纳多注射液阳性对照组18mg/kg，相当于人临床用药等效剂量2倍量(成人用药量为100mg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为100×0.018×5＝9mg/kg)。灌胃组灌胃给药，每日1次，连续3天；其余各组静脉注射给药，假手术对照组及脑缺血模型组给予生理盐水。末次给药后30分钟，参照Longa等人的方法采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合三氯乙醛(300mg/kg)ip麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。1小时后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
术后24小时后按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下0级未观察到神经症状。1级提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁。2级将动物置于光滑平面上，推手术侧向对侧移动时，阻力降低。3级动物自由行走时向手术对侧环转或转圈。4级软瘫，肢体无自发活动。
动物评分后，腹主动脉取血，断头取出大脑，称重，手术显微镜下确认中动脉已阻断后，平均分成5个脑片，置TTC染液中37℃避光温孵，10％甲醛固定24h后，根据重量法计算梗塞部重量占脑组织重量的百分比，作为脑梗塞范围大小的指标。测定血清SOD活性及MDA含量(比色法)，第二脑片组织常规脱水，石蜡包埋制片，HE染色，光学显微镜下观察病理组织学。
表6银杏内酯B粉针剂对局灶性脑缺血大鼠的影响(x±SD n＝10)

与假手术对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表7银杏内酯对局灶性脑缺血大鼠MDA含量及SOD活性的影响(x±SD n＝10)

与对照组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结论银杏内酯B粉针剂能降低局灶性脑缺血模型大鼠梗塞范围，改善大鼠由于脑缺血所致的神经行为障碍。能升高血清SOD活性及降低MDA含量。能减轻脑缺血大鼠脑组织的病理损伤。提示对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。
2、银杏内酯B粉针剂对犬脑血流量及脑血管阻力的影响取健康杂种犬，30条，♀、♂兼用，体重10-12kg，随机分为五组，对照组静脉注射生理盐水(2ml/kg)。银杏内酯B粉针剂小剂量组2.66mg/kg，中剂量组5.33mg/kg，大剂量组10.66mg/kg，均为静脉注射，用药量分别相当于人临床用药的等效剂量，2倍剂量，4倍剂量(成人用药量为100mg/日，按体表面积比值折算，犬用药的等效剂量为100×0.32/12＝2.66mg/kg)。金纳多注射液阳性对照组静脉注射5.33mg/kg，相当于人临床用药等效剂量2倍量。
动物自小隐静脉按30mg/kg静脉注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于手术台上。分离一侧股静脉，结扎远侧端，插输液管备用。分离一侧股动脉，插入充满肝素生理盐水溶液的动脉插管，经压力换能器记录平均动脉压(MAP)。将针状电极插入四肢皮下，记录标准II导心电图(ECG)。沿颈正中线切开皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎进入颅内之前的颈外动脉及椎动脉，保留颈内动脉，颈总动脉挂2.5mm电磁流量计探头测量颈内动脉流量，以此代表脑血流量。脑血流量以100g脑组织每分钟血流毫升数表示。脑血流量(ml/100g·min)＝颈内动脉流量×100/一侧脑重。脑血管阻力(kPa.ml/100g·min)＝平均血压(MAP)/脑血流量[1]。手术10min待动物各项观察指标稳定后，股静脉缓慢注射给药，给药体积2ml/kg，对照组给予等体积生理盐水，记录药前及药后1、5、30、60、120min的血压、颈内动脉流量、心电图。实验结束时处死动物，取脑组织称重。
表8银杏内酯B粉针剂对犬脑血流量的影响(ml/100g.min)(x±SDn＝6)

与给药前比较#P＜0.05，##P＜0.01；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表9银杏内酯B粉针剂对犬SAP、DAP、MAP的影响(x±SD，n＝6)


与对照组及给药前比较P＞0.05。
表10银杏内酯B粉针剂B对犬HR的影响(x±SD，n＝6)

与对照组及给药前比较P＞0.05。
表11银杏内酯B粉针剂对犬脑血管阻力的影响(kPa.ml/100g·min)(x±SD n＝6)

与给药前比较#P＜0.05，##P＜0.01；与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结论银杏内酯能使犬脑血流量增加、脑血管阻力降低，具有增加脑血流量的作用。而对血压及心率无明显影响。
3、银杏内酯B粉针剂对急性不完全性脑缺血大鼠的影响选择SD雄性大鼠70只，体重250-280g，随机分为7组假手术对照组；脑缺血模型组；银杏内酯B粉针剂小剂量组9mg/kg；中剂量组18mg/kg；大剂量组36mg/kg；银杏内酯灌胃给药对照组18mg/kg，；金纳多注射液阳性对照组18mg/kg。连续给药3天，末次给药后30分钟，大鼠ip水合氯醛麻醉，仰卧固定，切开颈正中皮肤，分离双侧颈总动脉，静脉注射伊文思蓝50mg/kg，5分钟后结扎双侧颈总动脉，缝合皮肤，常规消毒，假手术组分离双侧颈总动脉但不结扎，给伊文思蓝3小时后，断头取脑，称重，分别浸泡于甲酰胺溶液中，在45℃恒温箱中温育72小时，待脑组织中色素全部浸出，取色素液用721型分光光度计，波长620nm进行比色，根据标准曲线计算出脑内伊文思蓝的含量，以μg/g脑湿重表示。
表12银杏内酯B粉针剂对脑缺血模型大鼠脑组织伊文思蓝含量的影响(x±SD n＝10)

与对照组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结论银杏内酯B粉针剂能减少脑缺血模型大鼠脑组织中伊文思蓝的含量，减轻因脑缺血缺氧导致的毛细血管通透性的增加，对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。
4、银杏内酯B粉针剂对小鼠脑缺血缺氧的影响KM种小鼠，60只，雌、雄各半，随机分为6组对照组(生理盐水)；银杏内酯B粉针剂小剂量组13mg/kg；中剂量组26mg/kg；大剂量组52mg/kg(以上3组均为静脉注射给药)；银杏内酯灌胃给药组52mg/kg；金纳多注射液阳性对照组26mg/kg。每天给药一次，给药体积为20ml/kg。连续给药3天，末次给药后30min(iv)或60min(ig)，小鼠经乙醚麻醉后，分离双侧颈总动脉并穿线结扎，观察并记录结扎双侧颈总动脉后动物存活时间。以完全阻断双侧颈总动脉血流开始计时至小鼠10秒内呼吸少于2次时为止，为小鼠缺血后存活时间，试验结果见表8。银杏内酯B粉针剂可明显延长小鼠脑缺血后存活的时间，其中剂量为26，52mg/kg，差异具有显著性意义。
表13银杏内酯B粉针剂对小鼠脑缺血后存活时间的影响(n＝10，x±SD)

与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01结论实验结果显示，小鼠静脉注射给予银杏内酯B粉针剂(13，26，52mg/kg)及灌胃给予银杏内酯(52mg/kg)能不同程度的延长小鼠颈动脉结扎后的存活时间。提示银杏内酯B粉针剂对小鼠脑缺血缺氧具有一定的保护作用。其中相同剂量的银杏内酯静脉注射给药优于灌胃给药。

下面结合具体实施例对本发明的银杏内酯B粉针剂及其制备方法作进一步说明。
实施例1银杏内酯B 20.0g 碳酸钠30.0g丙二醇30.0g 右旋糖酐40120.0g
乳糖80.0g按处方比例将银杏内酯B、碳酸钠、丙二醇，加注射用水1500ml溶解，再加入右旋糖酐40和乳糖，使溶解，加注射用水定容至2000ml，截流分子量为0.8万Dolton的膜超滤，除去热源，最后用0.23μm滤膜过滤除菌，分装1000支，预冻与干燥，轧盖，得银杏内酯B粉针剂成品。
实施例2银杏内酯B 20.0g碳酸钠40.0g丙二醇 180.0g 右旋糖酐4060.0g乳糖40.0g按处方比例将银杏内酯B、碳酸钠、丙二醇，加注射用水1500ml溶解，再加入右旋糖酐40或乳糖，使溶解，加注射用水定容至2000ml，截流分子量为1万Dolton的膜超滤，除去热源，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，分装1000支，预冻与干燥，轧盖，得银杏内酯B粉针剂成品。
实施例3银杏内酯B 20.0g碳酸钠20.0g丙二醇 60.0g右旋糖酐4060.0g乳糖20.0g甘露醇20.0g按处方比例将银杏内酯B、碳酸钠、丙二醇，加注射用水1500ml溶解，再加入右旋糖酐40、乳糖和甘露醇，使溶解，加注射用水定容至2000ml，截流分子量为3万Dolton的膜超滤，除去热源，最后用0.22μm滤膜过滤除菌，分装1000支，预冻与干燥，轧盖，得银杏内酯B粉针剂成品。
将所得样品进行溶液配伍试验，影响因素试验，40℃±2℃相对湿度75％±5％条件下加速试验，结果均显示处方良好，外观成形佳，产品稳定，能够为抗过敏、抗炎、抗休克，抑制血小板聚集，减少血栓形成，治疗心脑血管系统疾病等提供一种较好的药物制剂。


本发明公开了一种银杏内酯B粉针剂，是由主药和助溶剂及赋形剂制成的粉针剂，其特征在于所述主药的主要成分为银杏内酯B，助溶剂为碳酸钠、丙二醇，按重量含量计其重量比是银杏内酯B∶碳酸钠∶丙二醇为1∶1～2∶1～10。还公开了这种粉针剂的制备方法。本发明的银杏内酯B粉针剂，药效稳定、成本低。