专利名称：一种螨变应原冻干疫苗及其制备方法变态反应性疾病被世界卫生组织(WHO)认为是当前世界性的重大卫生学问题， 2010年WHO把变态反应性疾病列为世界上第四大类最主要的慢性疾病。世界各国变态反应性疾病的总发病率约为10 20%，包括过敏性哮喘，是临床常见病，多发病。当前，变态反应疾病日趋严重，引起过敏的主要变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，而尘螨是世界性分布最强烈的变应原之一。哮喘是当今世界上最常见的疾患之一，哮喘患者约占人口总数的2_10%。全世界尘螨过敏的患者约有5000万，由尘螨过敏诱发的哮喘占哮喘的比例为10-30%。在尘螨过敏患者中，45-80%患者患有哮喘，尘螨过敏是诱发哮喘的一个主要因素。能引起人类变态反应疾病的尘螨主要有3种，即尘螨亚科中的尘螨属(Dermatophagoides)的两种户尘螨 (D. pteronyssinus)和粉尘螨(D. farinae)，以及蚍螨亚科中一种欧尘螨属(Euroglyphus) 的埋内欧尘螨，三种尘螨在抗原性强度方面比较，粉尘螨和户尘螨比埋内欧尘螨强得多。变应性鼻炎同样是一个全球性健康问题，它在世界各地均常见，其全球发病率 10% _25%，并且患者数仍有上升趋势。过敏性鼻炎严重影响了患者的日常生活、学习以及工作效率，增加了医疗的负荷。国内外研究显示，尘螨是变应性鼻炎最主要的变应原。目前，过敏性哮喘和过敏性鼻炎的治疗一般分为两种对症治疗和特异性免疫治疗。对症治疗一般采用化学药物，如抗组胺药物和糖皮质激素，化学药物治疗随着治疗时间的延长，会伴随一系列不良反应和副作用。如，化学药物的耐药性和糖皮质激素的长期应用对肾上腺皮质功能的轻度抑制。过敏性疾病的特异性免疫治疗自1911年noon和freeman 用花粉提取液治疗枯草热以来，已经广泛用于治疗过敏性疾病，并且取的飞跃的发展。变应原疫苗经历了粗浸液、纯化变应原疫苗、标准化变应原疫苗、类变应原疫苗的发展过程，在剂型上从皮下注射到舌下滴剂到舌下片剂的发展历程。在皮下注射给药和舌下含服给药两种给药方式中，各有优缺点。舌下给药免疫治疗病人更容易接受，依从好，但皮下注射给药相比舌下给药免疫治疗疗效快，治疗周期短，对于一些重症过敏患者，皮下注射给药治疗周期短，疗效更快。在目前上市的注射用螨变应原疫苗中，美国市场上常见的主要是甘油制剂，在欧洲变应原疫苗生产企业制备的主要是含有氢氧化铝佐剂的螨变应原疫苗。甘油制剂螨变应原疫苗由于含有50%的甘油，所以每次给药最大体积不能超过0. anl，限制了其使用的方便性；再者相比冻干疫苗的形式，它的稳定性不如冻干更稳定，使用时，由于含有50%甘油，会增加患者的疼痛。含有氢氧化铝佐剂的变应原疫苗，虽然铝盐具有极佳的安全性和佐剂活性的追踪记录，但是在应用铝盐时仍然存在一定的问题。这些问题包括局部反应如红斑、接触性过敏、皮下小结、以及肉芽肿性炎症、在实验动物和人类中特定的和总的IgE抗体反应增加(在某些病原情况下如过敏反应中出现不希望出现的抗体类型)。此外，已经报道了铝盐作为佐剂时对某些抗原无效。也有一些研究报道，铝盐能引起中枢神经系统实验性的变性病症。虽然仍没有关于包括铝的疫苗与人类的神经变性病症如阿尔茨海默氏疾病的发展有关临床证据，但是已经推定他们之间有联系并且由此引发了广泛的争论。在过敏性疾病的治疗过程中，不同于预防用疫苗，需要反复给药，治疗周期长达三年之久，在人体内累积的铝含量是不可忽视的问题。就稳定性而言，含有氢氧化铝佐剂的螨变应原疫苗不如冻干后的变应原疫苗更加稳定。冻干技术已经广泛用于食品和生物制品行业中，在药典三部记载的药品中，除了含有氢氧化铝佐剂的疫苗不是采用冻干的形式，其它药品都有冻干剂型上市。已证明药物冻干剂型不仅稳定性好，而且安全性高。
本发明旨在克服现有螨变应原疫苗的不足，提供一种新型的螨变应原冻干疫苗及其制备方法。为了实现本发明目的，本发明的一种螨变应原冻干疫苗，其是由螨变应原活性蛋白、冻干保护剂和PH7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液按1 100-1000 70-140的重量比混合后冻干制成；其中，所述冻干保护剂为甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、 乳糖或海藻糖中的一种或多种。优选地，其是由螨变应原活性蛋白、甘露醇和PH7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液按 1 200 70的重量比混合后冻干制成。 优选使用pH8. 0的磷酸盐缓冲液。所述螨变应原活性蛋白来自粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原和/或户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)变应原。优选所述螨变应原活性蛋白来自粉尘螨变应原和户尘螨变应原。更优选所述螨变应原活性蛋白来自等比例混合的粉尘螨变应原和户尘螨变应原。本发明还提供上述螨变应原冻干疫苗的制备方法，包括尘螨在培养基中的培养传代、螨体的分离纯化、活性蛋白的提取、活性蛋白的纯化以及冻干的步骤，其中，采用甘露醇、甘氨酸、人血白蛋白、葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的一种或多种作为冻干保护剂。前述的方法，包括以下步骤1)在培养基中接种尘螨，培养传代，收获尘螨培养物，用95 %乙醇灭活30min，静置后分层，弃去上清，所得固体物经自然干燥后，分离纯化螨体；2)向纯化后的螨体中加入95%乙醇进行脱脂，直至上清液无色，静置后分层，弃去上清，干燥所得固体物至无乙醇气味；3)向干燥后的固体物中加入pH7. 0-8. 5的磷酸盐缓冲液，搅拌后离心，得上清；过滤上清液，用截留分子量IkD IOkD的膜，以磷酸盐缓冲液衡滤，直至滤出液无色；滤出液经超滤浓缩后得螨变应原活性蛋白原液；4)向上述原液中加入冻干保护剂，经0. 22 μ m膜过滤除菌后，冻干即得。前述方法中冻干条件为以每分钟2. 5 3. 5°C /min的速度将温度降至-45°C，保持7 8h ；然后以每分钟0. 3 0. 40C /min的速度将温度升至_30°C，保持30 35h，维持真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度将温度升至25°C，保持50min，同时维持真空度为OPa ；再以0. 50C /min的速度将温度升至30°C，保持60min。前述方法中，所述尘螨为粉尘螨变应原和/或户尘螨变应原。优选为粉尘螨变应原和户尘螨变应原。更优选为等比例混合的粉尘螨变应原和户尘螨变应原。本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。1、原液制备1)户尘螨变应原活性蛋白原液的制备从工作种子库取出一瓶户尘螨工作种子，在25°C，相对湿度75% 士5%条件下放置15-30天复苏。在解剖镜下观察螨生长状况和活动度，螨生长良好，培养基没有真菌污染，将工作种子按1 60-1 12(螨种培养物与培养基重量比)的比例接种培养基O份实验动物饲料，2份酵母粉，1份猪肉粉)，于25°C、相对湿度75%条件下培养。户尘螨培养约2-4个月后，解剖镜下观察生长增殖情况良好时，精确称量全螨培养物在光学显微镜下用计数法计算虫体密度。当虫体密度达到约30-50只螨/mg培养物的标准即可收获培养物。将户尘螨培养物倒入三角瓶中，加入约2倍体积95%乙醇灭活30min，静置彻底分层， 小心弃去上清液体，将固体物转到滤纸上自然干燥，干燥过程中注意压散结块，最后所得的固体物为户尘螨收获物。以振动过筛的方法纯化螨体，重复几次，直到镜检杂质含量不得多于10粒/百只螨。在纯化后的螨体中加入约2倍体积的95%乙醇清洗一次，静置分层，弃去上层液体。然后再加入2倍体积的95%乙醇脱脂，每振摇;3min后静置lOmin，重复3次， 直到上清液无色为止。弃去废液后将固体物在滤纸上摊开干燥至少4 至无乙醇气味，干燥过程中注意压散结块。称取脱脂的户尘螨螨体原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中4°C搅拌提取Mh，离心分离去除残渣，滤液经8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐级过滤澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以 pH8. 050mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液衡滤，至滤出液为无色，超滤浓缩至体积为原体积的三分之一，收集回流液，经0. 22 μ m膜过滤除菌后得户尘螨变应原活性蛋白原液。2)粉尘螨变应原活性蛋白原液的制备从工作种子库取出一瓶粉尘螨工作种子，在25°C，相对湿度65% 士5%条件下放置15-30天复苏。在解剖镜下观察螨生长状况和活动度，螨生长良好，培养基没有真菌污染，将工作种子按1 60-1 12(螨种培养物与培养基重量比)的比例接种培养基(小麦胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相对湿度65% 士5%条件下培养。粉尘螨培养约2-4 个月后，解剖镜下观察生长增殖情况良好时，精确称量全螨培养物在光学显微镜下用计数法计算虫体密度。当虫体密度达到约30-50只螨/mg培养物的标准即可收获培养物。将粉尘螨培养物倒入三角瓶中，加入约2倍体积95%乙醇灭活30min，静置彻底分层，小心弃去上清液体，将固体物转到滤纸上自然干燥，干燥过程中注意压散结块，最后所得的固体物为粉尘螨收获物。以振动过筛的方法纯化螨体，直到镜检杂质含量不得多于10粒/百只螨。 在纯化后的螨体中加入约2倍体积的95%乙醇清洗一次，静置分层，弃去上层液体。然后再加入2倍体积的95%乙醇脱脂，每振摇:3min后静置lOmin，重复3次，直至上清液无色为止。弃去废液后将固体物在滤纸上摊开干燥至少4 至无乙醇气味，干燥过程中注意压散结块。称取脱脂的粉尘螨螨体原料，以1 50 1 10的投料比例置于pH8. 010 IOOmM 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中4°C搅拌提取Mh，离心分离去除残渣，滤液经8 μ m、 0. 45 μ m、0. 22 μ m膜逐级过滤澄清。用截留分子量IkD IOkD的膜，以pH8. 050mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液衡滤，至滤出液为无色，超滤浓缩至体积为原体积的三分之一，收集回流液，经0. 22 μ m膜过滤除菌后等粉尘螨变应原活性蛋白原液。2、半成品的稀配和分装冻干1)和2~)的原液经检验，活性不小于40000AU，无菌生长，用甘露醇水溶液稀释到规定浓度，甘露醇终浓度为2%。甘露醇溶液的配制方法按比例称取适量的甘露醇，用60°C注射用水定容至终体积的1/3，当温度降至30°C时，加入0. 2%针用活性炭，30°C搅拌30min。然后使用钛棒将药液过滤除去碳颗粒。脱碳后的甘露醇水溶液用60°C注射水定容至终体积，加入0. 05%针用活性炭，60°C搅拌吸附30分钟，用0. 8μπι膜过滤，除去活性炭，0. 22 μ m膜过滤除菌。稀配后的螨变应原原液经0.22 μ m膜过滤除菌后分装到西林瓶中，每瓶lml。半压塞放入冻干机腔体内，以每分钟2. 5 3. 5°C /min的速度将温度降至_45°C，保持7 他； 然后以每分钟0. 3 0. 40C /min的速度将温度升至_30°C，保持30 35h，维持腔内真空度10 151 ；再以1. 5 2V /min速度将温度升至25°C，保持50min，同时维持真空度为 OPa ；再以0. 50C /min的速度将温度升至30°C，保持60min，同时维持真空度OPa，即得螨变应原冻干疫苗。本发明的螨变应原冻干疫苗与现已上市的螨变应原疫苗的水制剂、甘油制剂、氢氧化铝佐剂制剂相比，具有如下优点(一)本发明的螨变应原冻干疫苗，不仅克服了传统变应原疫苗甘油制剂使用的不方便性和水制剂的不稳定性，例如，甘油制剂给病人带来的疼痛和使用剂量的限制，而且克服了含有氢氧化铝佐剂制剂因体内铝累积所带来的危害及副作用，为尘螨过敏患者提供一种高效、稳定性好、安全性好的疫苗制品。( 二)本发明突破变应原行业产品的传统，采用单剂量装量，提高了变应原疫苗使用的安全性和有效性。检验项目标准规定检验结果性状
水分活性 Derpl Derp2
无菌
无色疏松体，溶解后无色或
淡黄色澄明液体
<3%
10000AU-40000AU/ml
不得检出有菌生长
符合规定 1.7%
25000AU
9.8pg/ml
10.2pg/ml
符合规定注Derpl为户尘螨变应原主要致敏蛋白1 ；Derp2为户尘螨变应原主要致敏蛋白 2。实施例2粉尘螨变应原冻干疫苗的制备从工作种子库取出一瓶粉尘螨工作种子，在25 °C，相对湿度65%条件下放置 15-30天复苏。在解剖镜下观察螨生长状况和活动度，螨生长良好，培养基没有真菌污染，将工作种子按1 30 (螨种培养物与培养基重量比)的比例接种培养基(小麦胚芽粉酵母粉=1 1)，于25°C、相对湿度65%条件下培养。粉尘螨培养约3个月后，解剖镜下观察生长增殖情况良好时，精确称量全螨培养物在光学显微镜下用计数法计算虫体密度。当虫体密度达到约50只螨/mg培养物的标准即可收获培养物。将粉尘螨培养物倒入三角瓶中，加入约2倍体积95%乙醇灭活30min，静置彻底分层，小心弃去上清液体，将固体物转到滤纸上自然干燥，干燥过程中注意压散结块，最后所得的固体物为粉尘螨尘螨收获物。以振动过筛的方式纯化螨体，反复纯化几次，直到镜检杂质含量不得多于10粒/百只螨。在纯化后的螨体中加入约2倍体积的95%乙醇清洗一次，静置分层，弃去上层液体。然后再加入2倍体积的95%乙醇脱脂，每振摇:3min后静置lOmin，重复3次，直到上清液无色为止，弃去废液后将固体物在滤纸上摊开干燥至少4 至无乙醇气味，干燥过程中注意压散结块。称取脱脂的粉尘螨螨体原料，以1 50的投料比例置于50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中 4°C搅拌提取Mh，5000rpm, 4°C离心15min，取上清去残渣。上清经8 μ m、0. 45 μ m、0. 22 μ m 膜逐级过滤澄清。用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠衡滤， 到滤出液无色为时，超滤浓缩至体积为原体积的三分之一，收集回流液，经0. 22 μ m膜过滤除菌得粉尘螨变应原活性蛋白原液。原液经检，活性不小于40000AU，无菌生长，用甘露醇水溶液稀释到规定浓度，甘露醇终浓度为2%。甘露醇溶液)的配制按比例称取适量甘露醇，用60°C注射用水定容至终体积的1/3，当温度降至30°C时，加入0. 2%针用活性炭，30°C搅拌30min。然后使用钛棒将药液过滤除去碳颗粒。脱碳后的甘露醇溶液用60°C注射水定容至终体积，加入0. 05%针用活性炭，60°C搅拌吸附30分钟，用0. 8 μ m膜过滤，除去活性炭，经0. 22 μ m膜过滤除菌。稀配后的粉尘螨变应原活性蛋白原液0.22 μ m过滤除菌后分装到西林瓶中，每瓶 Iml0半压塞放入冻干机腔体内，以每分钟3°C /min的速度将温度降至_45°C，保持他；然后以每分钟0. 40C /min的速度将温度升至_30°C，保持30h，维持腔内真空度10 151 ；再以2V /min速度将温度升至25°C，保持50min，同时维持真空度为OPa ；再以0. 5°C /min的速度将温度升至30°C，保持60min，同时维持真空度OPa，即得粉尘螨变应原冻干疫苗。对所得冻干疫苗进行检验，结果如表2所示表2粉尘螨变应原冻干疫苗的检验
检验项目标准规定检验结果性状无色疏松体，溶解后无色或符合规定淡黄色澄明液体水分<3%1.6%活性10000AU-40000AU/ml23 OOOAUDerfl10.8pg/mlDer￡292xglm无菌不得检出有菌生长符合规定注Derfl为粉尘螨变应原主要致敏蛋白1 ；Derf2为粉尘螨变应原主要致敏蛋白 2。实施例3户尘螨和粉尘螨变应原冻干疫苗的制备户尘螨变应原活性蛋白原液和粉尘螨变应原活性蛋白原液按实施例1和实施例2 制备，原液检验合格后，用甘露醇溶液稀释至20000AU，甘露醇终浓度为2%。将稀释后的户尘螨变应原活性蛋白原液和粉尘螨变应原活性蛋白原液以1 1混合(体积比)，过滤除菌分装到西林瓶中，每瓶1ml。半压塞放入冻干机前箱内，按实施例1和实施例2的冻干工艺冻干，即得尘螨变应原合剂冻干疫苗。。对所得冻干疫苗进行检验，结果如表3所示 表3尘螨变应原合剂冻干疫苗的检验


本发明提供了一种新型的螨变应原冻干疫苗及其制备方法，所述疫苗是由螨变应原活性蛋白、冻干保护剂和pH7.0-8.5的磷酸盐缓冲液按1∶100-1000∶70-140的重量比混合后冻干制成。本发明的螨变应原冻干疫苗与传统的螨变应原疫苗的水制剂、甘油制剂、氢氧化铝佐剂制剂相比，克服了变应原疫苗甘油制剂使用的不方便性和水制剂的不稳定性以及含有氢氧化铝佐剂制剂所带来的副作用，为尘螨过敏患者提供一种高效、稳定性好、安全性好的疫苗制品。