专利名称：冻干带状疱疹减毒活疫苗及制备方法带状疱疹(herpes zoster，HZ)是由水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，VZV)引起的一种感染性皮肤病，中医称为“缠腰火龙“，俗称“蜘蛛疮“。初次感 染表现为水痘，常见于儿童。VZV可再度活动，生长繁殖，沿周围神经而波及皮肤，出现皮疹， 即带状疱疹。本病具有自限性，以中老年多见。患带状疱疹后患者一般可获得对该病毒的 终生免疫，但有0.5%的患者还可重患带状疱疹。VZV属疱疹病毒科α病毒亚科成员，人类 是其唯一宿主。近年来，带状疱疹的发病率明显增高，并且多易发生于老年人。好发部位为肋间神 经及三叉神经可支配的皮肤区域。疼痛可发生在皮疹出现前，表现为感觉过敏，轻触诱发疼 痛。皮肤水疱和疼痛一般2到3周后会自行缓解，有时可持续数月或数年之久。带 状疱疹病毒DNA在90%的成年人体内有表达，有的报道甚至高达95. 8%。这些病毒多为早期 患水痘时潜伏下的病毒，也有儿时接种水痘疫苗时所获得。还有个别母婴纵向传播的报道。 人一生发生带状疱疹的可能约为10%-20%。带状疱疹的发病率随着年龄的增加及免疫抑制 药物的应用日益增多。1974年日本大阪大学微生物研究所的Takahashi建立了 Oka株水痘-带状疱疹病 毒毒株，临床试验证明能产生良好的免疫效果和持久的免疫应答。
本发明为一种冻干带状疱疹减毒活疫苗，用于老年人预防带状疱疹。本发明还提供了冻干带状疱疹减毒活疫苗的制备方法。本发明提供的冻干带状疱疹减毒活疫苗，其特征为以Oka株水痘_带状疱疹病毒 制备的减毒活疫苗，制备的疫苗滴度不低于4. 5LgPFU/ml。本发明提供的冻干带状疱疹减毒活疫苗的制备方法，其特征为5%C02条件下以细 胞工厂为培养容器，制备高滴度的冻干带状疱疹减毒活疫苗，适于规模化生产；病变的初始 阶段去除牛血清白蛋白更有利于病毒繁殖；采用的保护剂为海藻糖-右旋糖酐保护剂，成 品2-8°C、18个月保存稳定性试验结果显示滴度稳定。本发明的技术解决方案如下包括Oka株水痘-带状疱疹病毒在2BS人二倍体细胞中的传代扩增、疫苗液的收获及 冻干，其特征在于利用细胞工厂制备冻干带状疱疹减毒活疫苗，适于规模化生产；采用的保 护剂为海藻糖-右旋糖酐保护剂，成品2-8°C、18个月保存稳定性试验结果显示滴度稳定； 制备的疫苗滴度不低于4. 5LgPFU/ml。具体生产工艺包括以下步骤(1)以Oka株水痘-带状疱疹病毒为毒种，以2BS人二倍体细胞为细胞基质，5%C02条 件下以细胞工厂为培养容器；(2)在步骤(1)的条件下，以pH7.2-7. 6、含10%-15%(ml/ml)小牛血清的MEM生长液对 2BS人二倍体细胞进行传代，细胞传代比例为1:2-1:4，37°C培养3_5天； (3)待步骤(2)中所述2BS人二倍体细胞长成均勻、致密的单层细胞后，以3/100— 8/100的感染复数加入Oka株水痘-带状疱疹病毒感染细胞，加入pH7. 2-`7. 6、含2% (ml/ml) 小牛血清的MEM维持液，置35°C培养；(4)当步骤(3)中所述2BS人二倍体细胞出现2%—10%的病变时，弃去细胞工厂内 液体，以相当于维持液3倍的阿氏液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入 PH7. 2-7. 6、含0. 1% (g/ml)人血白蛋白的MEM维持液，置35°C继续培养；(5)当步骤(4)中所述2BS人二倍体细胞出现75%以上的病变时，以阿氏液或PBS液清 洗细胞表面，排空洗液，加入0.0625% (g/ml)的胰蛋白酶消化液，40ml/层，待细胞呈疏松 状，加入MEM液，振摇至细胞脱落，收集至离心杯中；(6)将步骤(5)中所述细胞于2-8°C、IOOOrpm离心15分钟，离心后弃上清液，加入疫苗 液重悬沉淀，为疫苗原液。取疫苗原液做无菌试验，无菌检查合格后的原液合并，以高压细 胞破碎仪破碎细胞(1.5MPa)，经澄清过滤后即为半成品。其中疫苗液的成分为海藻糖4-9% (g/ml)、右旋糖酐 0.4-0. 8% (g/ml)、谷氨酸钠 1% (g/ml)、尿素 0. 3% (g/ml)、精氨酸 0. 3% (g/ml)、人血白蛋白0. 5-1. 5% (g/ml)的199培养基；
(7)将步骤(6)中所述半成品冰浴条件下，分装冻干。本发明的优点在于
制备工艺是在5%C02条件下以细胞工厂为培养容器，可使单位面积的细胞产量达到 5-6 X IO6个/ml，冻干苗滴度稳定地高于4. 5LgPFU/ml，适于规模化生产。5% CO2条件下使 用细胞工厂培养细胞密度可达5-6X IO6个/ml，较普通静置培养细胞密度多一个数量级， 从而有效地增加病毒产量，使冻干苗的滴度能稳定地高于4. 51gPFU/ml。3/100— 8/100的感染复数为Oka株水痘-带状疱疹病毒对2BS细胞的最佳感染 比例。冻干带状疱疹减毒活疫苗在制备过程中当病变达2%—10%时清洗细胞去除牛血 清白蛋白，因为此时病变程度较轻细胞状态相对比较好，因此喷洗可有效地保护细胞和病 毒不被洗液喷洗破坏、流走，更有利于病毒的繁殖。用浓度为0. 1%的人血白蛋白替代维持 液中的牛血清，可有效的维持病毒的繁殖，进而保证牛血清白蛋白残留量合格。将细胞由细胞工厂消化下来使用0. 0625% (g/ml)胰蛋白酶消化液，胰酶浓度低可 有效地保护细胞不被胰酶破坏，保持病毒活力。本发明制备方法采用的保护剂为海藻糖_右旋糖酐保护剂，成品2-8°C、18个月保 存，稳定性试验结果显示滴度稳定。制备的疫苗滴度可稳定地高于4. 51gPFU/ml，相对“蔗 糖_明胶保护剂”，可有效降低副反应。也可避免因明胶提炼自猪而引起的宗教信仰问题。

1. 2BS细胞按1:2的比例传代，MEM生长液的PH为7. 2、牛血清含量为10%(ml/ml)，37°C 培养3天，待细胞长成均勻、致密的单层。2.按3/100的感染复数以Oka株水痘-带状疱疹病毒感染步骤1中所述2BS细 胞，所用维持液的PH为7. 2、牛血清含量为2%(ml/ml)，35°C培养。3.当步骤2中所述细胞出现2%的病变时弃去细胞工厂内液体，以相当于维持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入pH7.2、含0. 1% (g/ml)人 血白蛋白的MEM维持液，置35 °C继续培养。4.当步骤3中所述细胞出现75%以上的病变时，弃去细胞工厂内液体，以阿氏液 或PBS液清洗细胞表面，排空洗液，加入0. 0625% (g/ml)胰蛋白酶消化液，40ml/层，待细胞 呈疏松状，加入MEM液，振摇至细胞脱落，收集至离心杯中；
5.将步骤4中所述细胞于2-8°C，IOOOrpm离心15分钟，离心后弃上清液，加入疫苗液 重悬沉淀，取疫苗原液做无菌试验，无菌检查合格后的原液合并，以高压细胞破碎仪破碎细 胞(1.5MPa)，经澄清过滤后即为半成品，其中疫苗液的成分为含海藻糖4% (g/ml)、右旋糖 酐0. 4% (g/ml)、谷氨酸钠1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白蛋白 0. 5% (g/ml)的 199 培养基；
6.将步骤5中所述半成品冰浴条件下，分装冻干。实施例2
1. 2BS细胞按1:3的比例传代，MEM生长液的PH为7. 4、牛血清含量为12%(ml/ml)，37°C 培养4天，以两层细胞工厂作为对照观察细胞形态，待细胞长成均勻、致密的单层。2.按5/100的感染复数以Oka株水痘-带状疱疹病毒感染步骤1中所述2BS细 胞，所用维持液的PH为7. 4、牛血清含量为2%(ml/ml)，35°C培养。3.当步骤2中所述细胞出现6%的病变时，弃去细胞工厂内液体，以相当于维持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入pH7. 4、含0. 1% (g/ml)人 血白蛋白的MEM维持液，置35 °C继续培养。4.当步骤3中所述细胞出现75%以上的病变时，弃去细胞工厂内液体，以阿氏液或 PBS液清洗细胞表面，排空洗液，加入0. 0625%胰蛋白酶消化液，40ml/层，待细胞呈疏松状， 加入MEM液，振摇至细胞脱落，收集至离心杯中。5.将步骤4中所述细胞于2-8°C，IOOOrpm离心15分钟，离心后弃上清液，加入疫 苗液重悬沉淀，取疫苗原液做无菌试验，无菌检查合格后的原液合并，以高压细胞破碎仪破 碎细胞(1.5MPa)，经澄清过滤后即为半成品，其中疫苗液的成分为含海藻糖6% (g/ml)、右 旋糖酐0. 6% (g/ml)、谷氨酸钠1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白 蛋白1% (g/ml)的199培养基；
6.步骤5中所述半成品冰浴条件下，分装冻干。实施例3
1. 2BS细胞按1:4的比例传代，MEM生长液的PH为7. 6、牛血清含量为15%(ml/ml)，37°C 培养5天，以两层细胞工厂作为对照观察细胞形态，待细胞长成均勻、致密的单层。2.按8/100的感染复数以Oka株水痘-带状疱疹病毒感染步骤1中所述2BS细胞，所用维持液的PH为7. 6、牛血清含量为2%(ml/ml)，35°C培养。3.当步骤2中所述细胞出现10%的病变时，弃去细胞工厂内液体，以相当于维持液 3倍的阿氏液或PBS液清洗细胞表面，充分振摇后排空洗液，加入pH7. 6、含0. l%(g/ml)人 血白蛋白的MEM维持液，置35 °C继续培养。4.当步骤3中所述当细胞出现75%以上的病变时，弃去细胞工厂内液体，以阿氏 液或PBS液清洗细胞表面，排空洗液，加入0. 0625%胰蛋白酶消化液，40ml/层，待细胞呈疏 松状，加入199液，振摇至细胞脱落，收集至离心杯中；
5.将步骤4中所述细胞于2-8°C，IOOOrpm离心15分钟，离心后弃上清液，加入疫苗液 重悬沉淀，取疫苗原液做无菌试验，无菌检查合格后的原液合并，以高压细胞破碎仪破碎细 胞(1.5MPa)，经澄清过滤后即为半成品，其中疫苗液的成分为含海藻糖9% (g/ml)、右旋糖 酐0. 8% (g/ml)、谷氨酸钠1% (g/ml)、尿素0. 3% (g/ml)、精氨酸0. 3% (g/ml)、人血白蛋白 1. 5% (g/ml)的 199 培养基；
6.步骤5中所述半成品冰浴条件下，分装冻干。试验例1
对实施例1-3生产的冻干带状疱疹减毒活疫苗进行检定，病毒滴定采用噬斑法；无菌 检查、异常毒性试验、外观、水分检定方法及标准见中华人民共和国药典三部；鉴别试验采 用中和法；牛血清白蛋白残留使用牛血清白蛋白检测试剂盒，标准见中华人民共和国药典 三部；热稳定性试验为37°C放置一周，之后采用噬斑法测定病毒滴度。各项检定结果见下 表
检定项目I猫实BW 2实删3
病寒滴度__4. 85LgFFV/ml_4.90LgPFV/ml_5. IlLgPFWml_
无菌检査￥1
热稳定性试验4.3OLgPFU/ml4.30L PFU/ml4. 41LgPFU/ml
__下降0. 55LgPFU/iBl 下降0.6 L#FU/ml 下降0.7 LgFFWmi
牛血清白蛋白残留 8ng/ml_lSng/ml_lOag/ml_
异蓠華性试验 符合规定符合规定符合规定
外观符合规定符合规定符合规定
水分__2 _3%_2%_
鉴别试验是水痘-带状疱疹病_ 是 K痘-带状疱疹病_ 是水痘-带状疱疹病_
试验例2
冻干带状疱疹减毒活疫苗2-8°C保存稳定性检定，将疫苗于2-8°C放置，以噬斑法定期 检测滴度，结果见下表
2-8 故置不同时间的病害滴度检验结果(单位LgPFU/ml) 实施例。月I 3月丨.8月12月 丨15月 18月
实施例 1 4.854.804. 774.904.804.82
实施例 2 4.904.954.85 4.904.80 4.89
实施例 3 5.11 I 5.0!4.925.1|4.965.0
试验例3以冻干带状疱疹减毒活疫苗免疫豚鼠，检测抗体水平及阳转率。以滴度分别为 40000PFU/ml, 100000PFU/ml,200000PFU/ml的冻干带状疱疹减毒活疫苗免疫豚鼠，以免疫 荧光抗体法检测抗体，阳转率分别达96%、98%、97%。 抗体几何平均滴度分别为32. 4,34. 3、 33. 5 ο


本发明涉及一种冻干带状疱疹减毒活疫苗及制备方法，属于生物技术领域，该疫苗用于预防老年人带状疱疹。包括Oka株水痘-带状疱疹病毒在2BS人二倍体细胞中的扩增传代、疫苗液收获及冻干。其特征在于利用细胞工厂制备冻干带状疱疹减毒活疫苗，适于规模化生产；采用的保护剂为海藻糖-右旋糖酐保护剂，成品2-8℃、18个月保存稳定性试验结果显示滴度稳定；制备的疫苗滴度不低于4.5LgPFU/ml。